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《水生微生物实验法》——不同类型微生物的分离方法(5)



录入时间:2010-9-9 15:56:57 来源:青岛海博

 

(五)硝化细菌的富集培养和分离

海洋、港湾、湖泊中的腐生细菌可以把动植物体分解成为氨或氨基酸,固氮菌等可将游离氮变成氨。而生长在水环境中的硝化细菌却能把氨或氨基酸转化为硝酸盐.如此生成的硝酸盐,正好是浮游植物必要吸收的有机营养物.氨在微生物作用下氧化成硝酸盐有两个过程,一是在亚硝化单胞菌属等一类亚硝化菌的作用下,使氨氧化成亚硝酸盐的过程.是一种放热反应,这个反应降低了热力电势,在25 下放出59400卡克-1热量;另一过程是由硝化杆菌属等氧化亚硝酸盐成硝酸盐,并放出18000卡克-1热量:

 1 .亚硝化细菌的富集培养

( l )富集培养基配制.

( NH4 )2SO4   0.2K

K2HPO4    0.1

MgSO4   0.05

NaCl  0.2

FeSO4  0.04

CaCO3MgCO3  0.5

100 毫升

pH 7.2

CaCO3MgCO3外,将其他成分溶解于水中,分装入锥形瓶,视瓶容量,每瓶装30-50毫升,液层厚约1厘米左右即可,而后按0.5%比例加入CaCO3MgCO3.塞上棉塞,包装好,在121 蒸汽下灭菌2O 分钟备用。

2)用取样器取近岸的富有机质的软海泥及污池泥或污沟软泥各1 份.各取少许泥样接种于锥形瓶中混匀。每个样品接种2 瓶,置20 下培养7-10 天。

3 NO2- 压的测定.在白色比色板的凹窝内加3 滴锌--淀粉液,滴入20%的硫酸,加培养液2 滴,如有NO2-存在立即出现蓝色.这证明培养基中的NH4+ 经亚硝化细菌作用已转化成为NO2- ,即有亚硝化细菌存在。也可用奈氏试剂检查有无氨态氮存在。若没有氨态氮存在,说明NH4+ 已被氧化为NO2- ,这也证明了亚硝化细菌的存在.另用未接种培养基作对照。若以陈海水为培养基的溶液时,由于海水含有NO2-  ,对照管也呈NO2- 阳性反应.这时可延长培养时间,检查NH4+ 的消失,但应注意实验室的空气中常常有氨态氮的存在。

4)当所有的氨被氧化后,在培养液中加1 毫升10%( NH4 )2SO4   ,如此重复几次.直到培养液中的亚硝化细菌很多为止。

2 .亚硝化细菌的分离与纯化

1)硅酸胶平板培养基的制法:用蒸馏水(约50 毫升)将比重为1.1950 毫升浓盐酸调到1.10,再用蒸馏水将市售的水玻璃的比重调到1.06-1.08 .将调好的水玻璃100 毫升倒入上液(不得反过来倒).两液混匀后立即分装于直径10 厘米的培养皿内,每皿装30 毫升,倒6 个平板。静置1 天,凝成平板后.用缓慢的流水漂洗3 天.至氯离子完全消失。用无菌水淋洗两次,倾去多余的水分即成硅酸胶平板.

将上述采用的培养基成分用量的一半加入20 毫升蒸馏水中溶解灭菌.每个硅酸胶平板加2 毫升此种培养液,轻轻转动培养皿,使培养液分布均匀。打开皿盖,在50 下烘至平板表面没有流动水为止(过干会使硅胶平板破裂)。

2)取富有机质的近岸海泥,污池软泥和污沟软泥样各少许点种于平板表面,三种样品各点种2个平板。为保持平板的水分,可在皿盖上放一张湿滤纸或将培养皿放在28-30 的湿室内培养15-30 天。由于硅酸胶平板有高度的选择性,在点样周围长出的都是亚硝化细菌。可挑此菌落于斜面培养待用。

3 .硝化细菌的富集培养

自然界中除自养菌能进行硝化作用外,近年来也报道了很多异养菌的硝化作用。许多异养菌能在含按盐的培养基中产生微量的亚硝酸。而某些真菌还能在培养基中氧化亚硝酸。即此二类微生物在一起能把铵转化为硝酸。

① 富集培养基的制备.

NaNO3  1

Na2CO3(无水)1

NaCl   0.5

K2HPO4   0.5

MgSO4   0.5

FeSO4  0.4 将这些药品溶于1000毫升水中.分装于1000毫升的锥形瓶中,于121 蒸汽下灭菌20 分钟,备用。

2)用3 个取样器分别取近岸有机质半富的海泥、河口软泥、污池泥。

3)三种样品各取少量,分别接种于培养基中混匀,在20-25 下培养5-7 天.

4)根据亚硝酸盐的消失,硝酸盐的形成,可验证细菌硝化作用过程第二阶段的存在。亚硝酸盐的消失可用格里斯(Griess )试剂或锌--淀粉溶液测定.用后者测定见前述,用前者测定,即加格里斯试剂(也称亚硝酸试剂)甲、乙液各2 滴于白瓷盘的凹窝,再加待测的培养液l 滴,如果亚硝酸盐被氧化完毕,则颜色不变,证明了硝化细菌的存在。也可将新鲜(无接种)的培养液作对照,这时未接种培养液反应为红色,即有亚硝酸盐的存在。

硝酸盐的测定,即在白瓷凹窝中加浓硫酸和二苯胺试剂各2 滴,如出现蓝色说明亚硝酸盐培养基在硝化细菌的作用下,已被氧化成硝酸盐.另外用未接种培养基作对照.

5)培养液中的亚硝酸盐被氧化完全后,加入10%亚稍酸钠溶液5 毫升,重复几次上述的实验后,可获得富集硝化细菌的培养液。

4 .硝化细菌的分离纯化

( 1 )试验步骤如下:

① 利用前述富集培养基配方加入1.5-2%琼脂,制成固体平板培养基.

取上述三种样品各5 ,分别加入5 毫升无菌水(海水样品用无菌海水)中.摇匀,各取上清液0.1毫升接种于平板上,每种样品各接种2 份,或用硅酸胶平板分离(见亚硝化细菌分离)。分离的菌落可接种于斜面培养基上培养,待用。

2)试剂配制:

① 锌--淀粉试剂的配法:将25氯化锌溶于25 毫升蒸馏水中,l 克淀粉溶于少量水,两液混合煮沸至淀粉溶解后,加入0.5 碘化锌,蒸馏水加至250 毫升即成(制成的溶液应是无色的).保存于棕色瓶中待用。

② 奈氏(Nessler )试剂的配制法,奈氏试剂(也称氨试剂)为碘化汞与碘化钾复盐(HgI·2KI )的碱性溶液,其配法有多种,现介绍一种如下;

a .甲液:碘化钾10 、蒸馏水100 毫升、碘化汞20 。

b .乙液:氢氧化钾20 、蒸馏水100 毫升。

分别按上列配方制备甲、乙两液。待冷后.将两液混合保存于暗色瓶中备用。为加速溶解,碘化汞可预先放在研钵中加几滴碘化钾研碎.

③ 格里斯(Griess )试剂配制:其配方有几种,现介绍常用的一种:

a .甲液:对氨基苯磺酸(即磺胺酸)0.8 、5N 醋酸( 1 份冰醋酸加2.5 份水)100 毫升,配时不能加热溶解.

b .乙液:α-奈胺0.5 、5N 醋酸100 毫升.加热溶解。

同时把甲、乙两液等量混合,但混合液不能较长时间保存。

④ 二苯胺试剂配法;二苯胺1.0溶在20 毫升蒸馏水中,然后徐徐加入浓硫酸100 毫升即成,保存在棕色瓶中备用。

 

 

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