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以紧密连接蛋白为靶标开发药物 2008-03-28


录入时间:2008-3-28 11:43:42
   
   药物靶标的选择和药物靶向传递的能力是药物开发的关键所在。最常见的药物靶标是膜蛋白,例如G蛋白偶联受体、离子通道和转运体,很少有人将相邻细胞之间的紧密连接(TJ)膜蛋白作为药物靶标。最近,TJ在细胞生物学方面的进展,揭示了TJ的屏障功能和防御功能,表明以TJ作为药物开发的靶标有着广阔前景。

  屏障功能和药物传递

  紧密连接膜蛋白Occludin和Claudin是控制物质穿过内皮和上皮细胞间连接的关键部件,直到上世纪90年代被发现之后,对细胞间路径/TJ机制的研究才开始逐步取得进展。研究人员建议,将以TJ为靶标的药物传递系统分为两类:第一代TJ调节剂(没有针对TJ的特异性成分)和第二代TJ调节剂(即针对TJ的特异性成分)。

  第一代TJ调节剂疏水分子的吸收主要通过简单扩散从细胞膜顶部进入上皮细胞。相反,亲水分子不能通过上皮细胞层。

  调整TJ屏障为低通透性药物的传递提供了可能。其实,早在20世纪60年代,人们就开始把TJ调整基因作为渗透促进剂进行研究。最初,常用表面活性剂和螯合剂增加药物的渗透性,后来发现胆盐和脂肪酸也能增加药物的渗透性。进一步研究这些渗透促进剂的作用机制后发现,有一些是通过细胞间途径来提高药物渗透性的--通过EDTA激活蛋白激酶  C耗竭细胞外钙和调节连接的完整性,导致细胞间隙扩大。目前临床上常用钠盐作为吸收促进剂-- 原理是通过磷脂酶C激活诱导钙依赖型肌动蛋白细丝收缩,从而打开TJ。其他调节TJ的渗透促进剂包括一氧化氮供体、甾体洗涤剂酰基肉碱和黏附聚合物。

  虽然这些物质增强了药物的渗透性,但在使用过程中也伴随着很多问题:靶分子的组织特异性非常低、有毒物质侵入、破坏细胞膜等。

  第二代TJ调节剂Occludin调节剂通过Oc鄄cludin调节TJ的公认方法是防止毗邻Occlu  din分子的相互作用。研究曾经表明,一种与Occludin细胞外区域相对应的合成肽,可以调节TJ的渗透性。据观察,TJ渗透性的变化和Occludin水平下降之间存在联系,而当用Occludin肽调节细胞时,TJ的其他成分,如Zo-1、Zo-2和Cingulin并没有受到影响。

  另一种与Occludin细胞外环相对应的短肽(14个氨基酸)可能是肠道和气道上皮细胞TJ调节子的一个新原型。此外,融入Oc鄄 cludin的睾丸特异性配体肽能够特异、可逆地调节血睾屏障。因此,这些肽可以作为Oc  cludin细胞外环路的拮抗剂,通过干扰细胞侧膜 Occludin分子间的相互作用来调节TJ。一个分子靶向分子融合到一个Occludin调节器,就可以产生一个新的药物输送策略。

  Claudin调节剂Claudin是TJ发挥屏障功能和选择性离子运输的一个关键分子。与Occlud  in相似, Claudin也是由四个跨膜蛋白和两个细胞外区域组成。但目前尚未有用与Claudin细胞外区域相对应的合成肽来调节TJ的相关报道。产气荚膜梭菌肠毒素(CPE)有两个功能域:N端细胞毒性域和C末端受体结合域。19  97年发现了CPE受体;1999年发现Claudin-4是相同的CPE受体。C端CPE(C-CPE)处理的结果是,紧密连接的完整性下降,同时Claudin-4水平下降。还有研究发现,C-CPE增强空肠吸收的能力是临床用作吸收促渗剂的癸酸钠的400多倍。此外,Claudin-1和Claudin-5缺陷小鼠的数据显示,Claudin  -1、Claudin-5通过表皮给药和通过血脑屏障给药都是有效的。

  防御功能和药物开发

  TJ的防御功能对维持细胞极性发挥了极其重要的作用。极性细胞表面蛋白不对称分布,如离子通道、载体和受体。TJ防御功能失调导致膜蛋白极性位置的改变,这表明Claudin可间接参与药物靶点。

  Claudin下调和肿瘤Claudin水平减少可能与细胞极性失调和恶性肿瘤有关。事实上,Claud  in-1在乳腺癌和结肠癌中是降低的;Claudin-7在浸润性乳癌和头颈癌中是下降的。这些癌症中TJ蛋白表达减少与大家普遍接受的观念是一致的,即肿瘤形成伴随着TJ断裂,这一过程在癌症细胞失去凝聚力、侵袭性、缺乏分化中可能起着重要作用。此外,Claudin-4过度表达伴有体内、外胰腺细胞侵入可能性的显著减少。致癌Raf-1转染到唾液腺上皮细胞株,导致Claudin-1下调和TJ功能损失。这些研究结果显示,一个激活的Claudin屏障保持细胞极性可能是一种新型抗肿瘤剂,能够阻碍恶性肿瘤的进展。最近,研究人员研究表明,低甲基化Claudin-4等位基因与Claudin-4在卵巢癌细胞株的过度表达相一致。而且,脱甲基剂细胞治疗导致Claudin-4阴性卵巢癌细胞发生了Claudin-4的表达。除了Claudin、Occludin启动子的 CpG岛在人肝癌和小鼠黑色素瘤中高度甲基化,Occludin的后生遗传沉默至少在某种程度上也可能参与了肿瘤的发展。综合考虑,Claudin和 O  c鄄cludin表达的外遗传控制可能也是一种新的肿瘤治疗策略。

  Claudin上调和肿瘤Claudin缺失被认为是细胞黏附缺失机制和癌症转移发展的重要步骤。然而,许多Claudin(如 Claudin-3和Claudin-4)在多种癌症(如卵巢癌、前列腺癌和乳癌)中表现为典型的上调。这提示Claudin在肿瘤发生中有正面影响作用。Claudin-1和Claudin-4均在鳞状细胞癌中表达,Claudin-3和Claudin-4表达与卵巢癌细胞的侵袭、活力和细胞存活的增加有关。

  考虑到Claudin在TJ屏障和维持细胞极性中扮演了重要角色,Claudin上调似乎和肿瘤发生相矛盾。对于这种差别有两种解释:首先,Claudin过度表达可能导致TJ屏障功能障碍。Claudin在外侧膜形成异型和同型条带,相邻的条带彼此联合,从而形成TJ屏障。条带中 24个Claudin家族成员的组合对于TJ屏障性质具有关键性决定作用,其比例发生改变可引起TJ屏障遗漏结构的形成。这表明,在某些生理条件下 Claudin对于TJ屏障起着主导的负调控作用。其次,在初始转移阶段,Claudin可直接发挥作用。Claudin过度表达促进了基质金属蛋白酶 (MMP)的活性。MMP是一个前转移因子,介导膜型基质金属蛋白酶(MT-MMP)。Claudin-1和  Claudin-3/Claudin-4 通过分别加工口腔鳞状细胞癌细胞和卵巢上皮细胞中的MMP,增强侵入活动。C  laudin和MT-MMP并不受限于TJ条带,并在细胞膜中局部扩散。所以,Claudin也许能够固定MMP和M  T-MMP,这导致侵入机制复合物的形成。这些研究结果表明,有些Claudin可以针对肿瘤药物,像 CPE在Cla  udin表达肿瘤中表现出抗肿瘤活性,如对乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌细胞。

  总之,细胞极性异常靶因子可能是发现药物的最佳候选。以claudin为基础的策略,可以促使开发一种新型药物。

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  上皮细胞连接复合体位于细胞侧膜的顶部,由三种成分构成:TJ、黏附连接和桥粒。黏附连接和桥粒处相邻细胞间隙为15~20纳米,而在TJ处相邻细胞膜彼此紧密相接,细胞间隙完全封闭,被称为吻合点。在一些简单的上皮层中,黏附连接和桥粒对相邻细胞的机械连接发挥重要作用,而TJ对细胞间的封闭有至关重要的作用。

  1993年,Furuse等人发现了TJ带的第一个成分膜蛋白Occludin;1998年他们又发现了新的TJ带成分--Claudin-1和Claudin-2。

  TJ具有两个重要功能:屏障作用和防御作用。屏障功能对组织划分有重要作用,可调节药物传递到靶组织的能力。细胞都具有极性,转运体和受体等膜分子的定位都由TJ控制,防止膜两侧物质自由进出。在某些疾病状态下,例如癌症,TJ的功能异常会导致细胞极性破坏,表明TJ蛋白可能是一个药物靶向分子。

 

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