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食品微生物学检验 大肠菌群计数 征求意见稿



录入时间:2016-1-28 14:41:33 来源:青岛银河澳门官网入口

1 范围

本标准规定了食品中大肠菌群( Coliforms)计数的方法。

本标准适用于食品中大肠菌群的计数。

2 术语和定义

2.1 大肠菌群 coliforms 
在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
2.2 最可能数 most probable number,MPN

基于泊松分布的一种间接计数方法。

3 检验原理

3.1  MPN

MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后,根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度,应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。

3.2 平板计数法

大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸,在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色,带有或不带有沉淀环的菌落。
设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
4.1 恒温培养箱: 36 ℃ ±℃。
4.2 冰箱: ℃~℃ 。
4.3 恒温水浴箱: 46℃±1℃ 。
4.4 天平:感量 0.1 g。
4.5 均质器。
4.6 振荡器。
4.7 无菌吸管: 1 mL(具 0.01 mL 刻度)、 10 mL(具 0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头。
4.8 无菌锥形瓶:容量 500 mL。
4.9 无菌培养皿:直径 90 mm。
4.10 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。
4.11 菌落计数器。
5 培养基和试剂

5.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨( Lauryl Sulfate Tryptose, LST)肉汤:见附录 中 A.1。
5.2 煌绿乳糖胆盐( Brilliant Green Lactose Bile, BGLB)肉汤:见附录 中 A.2。
5.3 结晶紫中性红胆盐琼脂( Violet Red Bile Agar, VRBA):见附录 中 A.3。
5.4 磷酸盐缓冲液:见附录 中 A.4。
5.5 无菌生理盐水:见附录 中 A.5。
5.6 无菌 1 mol/L NaOH:见附录 中 A.6。
5.7 无菌 1 mol/L HCl:见附录 中 A.7。

第一法 大肠菌群 MPN 计数法

6 检验程序
大肠菌群MPN计数的检验程序见图。

图1 大肠菌群 MPN 计数法检验程序

7 操作步骤
7.1 样品的稀释
7.1.1 固体和半固体样品:称取 25 g 样品,放入盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内 ,8000 r/min10000 r/min 均质 1 min2 min,或放入盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器以6/s9/s拍打 1 min2 min,制成 1:10 的样品匀液。
7.1.2 液体样品:以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中充分振摇或置于机械振荡器中振摇,充分混匀,制成 1:10 的样品匀液。
7.1.3 样品匀液的 pH 值应在 6.57.5 之间,必要时分别用 1 mol/L NaOH 或 1 mol/L HCl 调节。

7.1.4 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL,沿管壁缓缓注入 9 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用 支 1 mL 无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成 1:100 的样品匀液。
7.1.5 根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释次,换用 1 mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15 min。
7.2 初发酵试验
每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3
管月桂基硫酸盐胰蛋白胨( LST)肉汤,每管接种1mL(如接种量超过1 mL,则用双料LST肉汤), 36℃ ±℃培养24 h±2 h,观察倒管内是否有气泡产生, 24 h±2 h产气者进行复发酵试验(证实试验),如未产气则继续培养至48 h±2 h,产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。
7.3 复发酵试验(证实试验)
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物环, 移种于煌绿乳糖胆盐肉汤( BGLB) 管中, 36 ℃ ±1℃培养48 h±2 h,观察产气情况。产气者,计为大肠菌群阳性管。

7.4大肠菌群最可能数(MPN)的报告

7.3确证的大肠菌群LST阳性管数,检索MPN表(见附录B),报告每gmL)样品中大肠菌群的

MPN值。

第二法 大肠菌群平板计数法

8 检验程序
大肠菌群平板计数法的检验程序见图2。

图2 大肠菌群平板计数法检验程序

9 操作步骤

9.1 样品的稀释
7.1进行。
9.2 平板计数
9.2.1 选取2个~3个适宜的连续稀释度每个稀释度接种2个无菌平皿,每皿1 mL。同时取1 mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。
9.2.2 及时将15 mL20 mL冷至46 ℃的结晶紫中性红胆盐琼脂( VRBA)约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀,待琼脂凝固后,再加3 mL4 mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板,置于36 ℃ ±℃培养18 h24 h。
8.3 平板菌落数的选择
选取菌落数在 15 CFU150 CFU 之间的平板,分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落(如菌落直径较典型菌落小)。典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为 0.5 mm 或更大。

9.4 证实试验
从 VRBA 平板上挑取 10 个不同类型的典型和可疑菌落,分别移种于 BGLB 肉汤管内, 36 ℃ ±℃培养 24 h~48 h,观察产气情况。凡 BGLB 肉汤管产气,即可报告为大肠菌群阳性。 
9.5 大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以9.3中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每g
( mL)样品中大肠菌群数。例: 10-4样品稀释液1 mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为: 100×6/10×104/g( mL=6.0×105CFU/g( mL)。

附  录A
培养基和试剂

A.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤
A.1.1 成分
胰蛋白胨或胰酪胨                           20.0 g
氯化钠                                     5.0 g
乳糖                                       5.0 g
磷酸氢二钾(K2HPO4)                      2.75 g
磷酸二氢钾( KH2PO4)                     2.75 g
月桂基硫酸钠                               0.1 g
蒸馏水                                     1 000 mL
pH 6.8±0.2
A.1.2 制法
将上述成分溶解于蒸馏水中,调节 pH。分装到有玻璃小倒管的试管中,每管 10 mL。 121 ℃高压灭菌 15 min。
A.2 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤
A.2.1 成分
蛋白胨                                      10.0 g
乳糖                                        10.0 g
牛胆粉( oxgalloxbile)溶液                200 mL
0.1%煌绿水溶液                              13.3 mL
蒸馏水                                      800 mL
pH 7.2±0.1
A.2.2 制法
将蛋白胨、乳糖溶于约500 mL蒸馏水中,加入牛胆粉溶液200 mL(将20.0 g脱水牛胆粉溶于200 mL蒸馏水中,调节pH7.07.5),用蒸馏水稀释到975 mL,调节pH,再加入0.1%煌绿水溶液13.3 mL,用蒸馏水补足到1 000 mL,用棉花过滤后,分装到有玻璃小倒管的试管中,每管10 mL。 121 ℃高压灭菌15 min。
A.3 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)
A.3.1 成分
蛋白胨                                     7.0 g
酵母膏                                     3.0 g
乳糖                                       10.0 g
氯化钠                                     5.0 g
胆盐或3号胆盐                             1.5 g
中性红                                     0.03 g
结晶紫                                     0.002 g
琼脂                                       15 g18 g
蒸馏水                                     1 000 mL
pH 7.4±0.1

A.3.2 制法
将上述成分溶于蒸馏水中,静置几分钟,充分搅拌,调节pH。煮沸2 min,将培养基冷却至45 ℃~
50 ℃倾注平板。使用前临时制备,不得超过3 h。
A.4 磷酸盐缓冲液
A.4.1 成分
磷酸二氢钾( KH2PO4)                        34.0 g
蒸馏水                                        500 mL
pH 7.2
A.4.2 制法
贮存液:称取34.0 g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中,用大约175 mL1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH,用蒸馏水稀释至1 000 mL后贮存于冰箱。稀释液:取贮存液1.25 mL,用蒸馏水稀释至1 000 mL,分装于适宜容器中, 121 ℃高压灭菌15 min。
A.5 无菌生理盐水
A.5.1 成分
氯化钠                                        8.5 g
蒸馏水                                        1000 mL
A.5.2 制法
称取8.5g氯化钠溶于1000 mL蒸馏水中, 121 ℃高压灭菌15 min。
A.6 1 mol/L NaOH
A.6.1 成分
NaOH                                         40.0 g
蒸馏水                                        1000 mL
A.6.2 制法
称取40 g氢氧化钠溶于1000 mL蒸馏水中, 121 ℃高压灭菌15 min。
A.7 1 mol/L HCl
A.7.1 成分
HCl                                          90 mL
蒸馏水                                       1000 mL
A.7.2 制法
移取浓盐酸90 mL,用蒸馏水稀释至1000 mL, 121 ℃高压灭菌15 min。

附  录B

大肠菌群最可能数(MPN)检索表

   B.1大肠菌群最可能数(MPN)检索表

gmL)检样中大肠菌群最可能数(MPN)的检索见表B.1。

表B.1  大肠菌群最可能数(MPN)检索表

阳性管数

MPN   

95%可信限

阳性管数

MPN

95%可信限

0.10

0.01

0.001

下限

上线

0.10

0.01

0.001

下限

上限

0

0

0

3.0

--

9.5

2

2

0

21

4.5

42

0

0

1

3.0

0.15

9.6

2

2

1

28

8.7

94

0

1

0

3.0

0.15

11

2

2

2

35

8.7

94

0

1

1

6.1

1.2

18

2

3

0

29

8.7

94

0

2

0

6.2

1.2

18

2

3

1

36

8.7

94

0

3

0

9.4

3.6

38

3

0

0

23

4.6

94

1

0

0

3.6

0.17

18

3

0

1

38

8.7

110

1

0

1

7.2

1.3

18

3

0

2

64

17

180

1

0

2

11

3.6

38

3

1

0

43

9

180

1

1

0

7.4

1.3

20

3

1

1

75

17

200

1

1

1

11

3.6

38

3

1

2

120

37

420

1

2

0

11

3.6

42

3

1

3

160

40

420

1

2

1

15

4.5

42

3

2

0

93

18

420

1

3

0

16

4.5

42

3

2

1

150

37

420

2

0

0

9.2

1.4

38

3

2

2

210

40

430

2

0

1

14

3.6

42

3

2

3

290

90

1000

2

0

2

20

4.5

42

3

3

0

240

42

1000

2

1

0

15

3.7

42

3

3

1

460

90

2000

2

1

1

20

4.5

42

3

3

2

1100

180

4100

2

1

2

27

8.7

94

3

3

3

1100

420

--

1:本表采用3个稀释度[0.1g(mL)、0.01g(mL)、0.001g(mL)],每个稀释度接种3管。

2:表内所列检样量如改用1g(mL)、0.1g(mL)0.01g(mL)时,表内数字应相应降低10倍;如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)0.00001g(mL)时,则表内数字应相应增高10倍,其余类推。

 

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