【GB/T 16347—1996】 
乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物学检验 
　　1　主题内容与适用范围
　　本标准规定了乳酸菌饮料中乳酸菌检验的技术要求。
　　本标准适用于以鲜乳、乳粉或辅以大豆等为原料，经乳酸菌发酵加工制成的具有相应风味的活性乳酸菌饮料。
　　2　引用标准
　　GB 4789.28　食品卫生微生物学检验　染色法、培养基和试剂
　　3　术语
　　乳酸菌：一群能分解葡萄糖或乳糖产生乳酸，需氧和兼性厌氧，多数无动力，过氧化氢酶阴性，革兰氏阳性的无芽胞杆菌和球菌。
　　乳酸菌菌落总数：检样在一定条件下培养后，所得1mL检样中所含乳酸菌菌落的总数。
　　4　设备和材料
　　4.1　温箱：36±1℃。
　　4.2　冰箱：0～4℃。
　　4.3　恒温水浴：46±1℃。
　　4.4　电炉：可调式。
　　4.5　吸管：容量为1，10和25mL。
　　4.6　广口瓶或三角瓶：容量为500mL。
　　4.7　平皿：直径为9cm。
　　4.8　试管：18×180mm。
　　4.9　显微镜。
　　5　培养基和试剂
　　5.1　改良TJA培养基(改良番茄汁琼脂培养基)。
　　5.2　改良MC培养基(Modified Chalmers培养基)。
　　5.3　0.1%美兰牛乳培养基。
　　5.4　6.5%氯化钠肉汤。
　　5.5　pH9.6葡萄糖肉汤。
　　5.6　40%胆汁肉汤。
　　5.7　淀粉水解培养基。
　　5.8　精氨酸水解培养基。
　　5.9　乳酸杆菌糖发酵管。
　　5.10　七叶苷培养基。
　　5.11　革兰氏染色液：按GB 4789.28规定执行。
　　5.12　3%过氧化氢溶液：按GB 4789.28规定执行。
　　5.13　蛋白胨水、靛基质试剂：按GB 4789.28规定执行。
　　5.14　明胶培养基：按GB 4789.28规定执行。
　　5.15　硝酸盐培养基、硝酸盐试剂：按GB 4789.28规定执行。
　　5.16　生理盐水：定量分装于三角瓶和试剂管内灭菌。
　　6　乳酸菌菌落总数的测定　　
　　6.1　检验程序
　　乳酸菌菌落总数检验程序如下：
　　（略）
　　6.2　操作步骤
　　6.2.1　以无菌操作将经过充分摇匀的检样25mL(或25g)放入含有225mL灭菌生理盐水的灭菌广口瓶内作成1∶10的均匀稀释液。
　　6.2.2　用1mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液)。
　　6.2.3　另取1mL灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增一次，即换用1支1mL灭菌吸管。
　　6.2.4　选择2～3个以上适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。
　　6.2.5　稀释液移入平皿后，应及时将冷至50℃的乳酸菌计数培养基(改良TJA或改良MC)注入平皿约15mL，并转动平皿使混合均匀。同时将乳酸菌计数培养基倾入加有1mL稀释液检样用的灭菌生理盐水的灭菌平皿内作空白对照，以上整个操作自培养物加入培养皿开始至接种结束须在20min内完成。
　　6.2.6　待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养72±3h取出，观察乳酸菌菌落特征(见表1)，选取菌落数在30～300之间的平板进行计数。计算后，随机挑取5个菌落数进行革兰氏染色，显微镜检查并做过氧化氢酶试验。革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，无芽胞的球菌或杆菌可定为乳酸菌。根据证实为乳酸菌菌落计算出该皿内的乳酸菌数，然后乘其稀释倍数即得每毫升样品中乳酸菌数。例如，检样10－4的稀释液在改良TJA琼脂平板上，生成的可疑菌落为35个，取5个鉴定，证实为乳酸菌的是4个，则1mL检样中乳酸菌数为：
　　 
　　6.3　乳酸菌在改良TJA和改良MC培养基上菌落生长形态特征见表1。
　　表1　乳酸菌在不同培养基上菌落特征
　　（表略）
　　7　乳酸菌的鉴定
　　对上述分离到的乳酸菌需进行菌种鉴定时，则作以下试验。
　　7.1　菌种制备：自平板上挑取菌落，接种于改良TJA或改良MC琼脂斜面，于36±1℃，24～48h培养，刮取菌苔，分别进行下列试验。
　　7.2　乳酸杆菌鉴定试验：极少见还原硝酸盐，不液化明胶，不产生靛基质和硫化氢。
　　7.3　常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应，见表2。
　　7.4　产乳酸的链球菌的鉴别试验，见表3。
　　表2　常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应
　　（表略）
　　表3　 乳酸的链球菌的鉴别表
　　（表略）

 

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