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免疫磁珠捕获与分离大肠埃希氏菌



录入时间:2014-3-14 11:11:14 来源:银河澳门官网入口

免疫磁珠捕获与分离

应按照生产商提供的使用说明进行免疫磁珠捕获与分离。当生产商的使用说明与下面的描述可能有偏差时,按生产商提供的使用说明进行。

将Eppendorff 管按样品和质控菌株进行编号,每个样品使用1 Eppendorff 管,然后插入到磁板架上。在漩涡混合器上轻轻振荡E.coli O157 免疫磁珠溶液后,用开盖器打开每个Eppendorff 管的盖子,每管加入20μL E.coli O157 免疫磁珠悬液。

取mEC+n 肉汤增菌培养物1mL,加入到Eppendorff 管中,盖上盖子,然后轻微振荡10s。每个样品更换1 只加样吸头,质控菌株必须与样品分开进行,避免交叉污染。

结合:在18℃~30℃环境中,将上述Eppendorff 管连同磁板架放在Dynal MX1 样品混合器上转动或用手轻微转动10min,使E.coli O157 与免疫磁珠充分接触。

捕获:将磁板插入到磁板架中浓缩磁珠。在3min 内不断地倾斜磁板架确保悬液中与盖子上的免疫磁珠全部被收集起来,此时,在Eppendorff 管壁中间明显可见圆形或椭圆形棕色聚集物。

吸取上清液:取1 支无菌加长吸管,从免疫磁珠聚集物对侧深入液面,轻轻吸走上清液。当吸到液面通过免疫磁珠聚集物时,应放慢速度,以确保免疫磁珠不被吸走。

免疫磁珠的滑落:某些样品特别是那些富含脂肪的样品,其磁珠聚集物易于滑落到管底。在吸取上清液时,很难做到不丢失磁珠,在这种情况下,可保留50μL~100μL 上清液于Eppendorff 管中。如果在后续的洗涤过程中也这样做的话,脂肪的影响将减小,也可达到充分捕获的目的。

洗涤:从磁板架上移走磁板,在每个Eppendorff 中加入1mL PBS-Tween20

洗液,转动磁板架3 次以上,洗涤免疫磁珠混合物。

免疫磁珠悬浮:移走磁板,将免疫磁珠重新悬浮在100μL PBS-Tween20 洗液中。

涂布平板

用漩涡混合器将免疫磁珠混匀,用加样器各取50μL 免疫磁珠悬液分别转移至CT-SMAC 平板和改良CHROMagar O157 显色琼脂平板一侧,然后用无菌涂布棒将免疫磁珠涂布平板的一半,再用接种环划线接种平板的另一半。待琼脂表面水分完全吸收后,翻转平板,于36℃±1℃培养18h~24h。

注:若CT-SMAC 平板和改良CHROMagar O157 显色琼脂平板表面水分过

多时,应在37℃下干燥10min~20min,涂布时避免将免疫磁珠涂布到平板的边缘。

 

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