出口食品中蜡样芽孢杆菌检验方法
1主题内容与适用范围
2本标准规定了出口食品中蜡样芽孢杆菌的检验方法。
2 设备和材料
2.1 吸管：容量1.0mL和10.0mL,具0.1mL刻度。
2.2 菌落计数器。
2.3 均质器。
2.4 厌氧培养装置。
2.5 涡动搅拌器。
2.6 L形玻璃棒。
2.7 恒温培养箱: 30℃及36±1℃。
3 培养基和试剂
3.1 甘露醇卵黄多粘菌素琼脂(MYP)。
3.2 胰酪胨大豆多粘菌素肉汤。
3.3 酚红葡萄糖肉汤。
3.4 硝酸盐肉汤。
3.5 营养琼脂。
3.6 L-酪氨酸营养琼脂。
3.7 溶菌酶营养肉汤。
3.8 改良V-P培养基。
3.9 动力培养基。
3.10 胰酪胨大豆羊血琼脂(TSSB)。
3.11 Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液。
3.12 亚硝酸盐试剂。
3.13 V-P试剂。
3.14 碱性复红染色液。
4 样品的保存和送检
待检样品应保持在6℃以下运送并尽可能不使其冷冻。送达实验室后,应保存于4℃并
尽快进行检验。如在4d内不能进行检验,应将样品储存在-20℃,检验前再于室温下解冻。
脱水食品可在常温下送检和储存。
5 样品的制备
5.1 以无菌操作用灭菌刀、剪将样品剪碎。称取50 g放于无菌均质杯中。
5.2 加450 mL无菌磷酸盐缓冲稀释液于均质杯中以18000～20000 r/min均质2min。制成
1 : 10样品稀释液。
5.3 取1: 10稀释液10.0 mL加到含有90.0 mL无菌磷酸盐缓冲液的稀释瓶中,充分混匀制
成1 : 100的稀释液。
5.4 每个稀释度换用1支10.0mL灭菌吸管,按上述操作程序进行10倍递增稀释直至10**-6。
6 检验步骤
6.1 平板计数法
6.1.1 取各稀释液0.1mL接种到MYP琼脂平板上。用灭菌L形玻璃棒均匀涂布于整个琼脂
表面。每稀释度接种两个MYP琼脂平板。
6.1.2 将平板置于30℃培养24 h。
6.1.3 选取具有15～150个典型或可疑蜡样芽孢杆菌菌落的平板,进行计数。并计算同
一稀释度两个平板的平均菌落数。
蜡样芽孢杆菌在MYP琼脂平板上生成的菌落为微粉红色,环绕产生卵磷脂酶沉淀环。
如反应不典型,可继续培养24h再计数。
6.1.4 计数后,从每个平板至少选取5个已计数的菌落分别接种于营养琼脂斜面,于30℃
培养24 h,按第6章进行证实试验。
6.1.5 根据证实试验确定为蜡样芽孢杆菌的菌落数,按比例计算出该皿内的蜡样芽孢杆
菌菌落数,然后乘其稀释倍数再乘以10,即得每克样品所含蜡样芽孢杆菌数并作出报告。
例:将检样10**-4稀释液0.1mL涂布于MYP琼脂平板上,生成的可疑菌落数为25个,取5个进
行鉴定,证实为蜡样芽孢杆菌的是4个,则1 g样品中蜡样芽孢杆菌数为(25×4/5)×10**4
×10＝2×10**6。
6.2 最近似值(MPN)法
适用于污染蜡样芽孢杆菌数不大于10**3个/g的食品。
6.2.1 选用三管法MPN系列。取10**-1、10**-2、10**-3三种稀释液,每种稀释液接种3
管胰酪胨大豆多粘菌素肉汤,每管接种1mL。
6.2.2 置于30℃培养48±2 h。
6.2.3 从长菌的试管取培养物划线接种到MYP琼脂平板上。
6.2.4 置30℃培养24～48 h。
6.2.5 从MYP琼脂平板上挑取粉红色绕有沉淀环的单个菌落,接种营养琼脂斜面,置30℃
培养24 h,供作证实试验。
6.2.6 根据证实试验确定为蜡样芽孢杆菌的管数,由MPN表 [附录C(补充件)]计算蜡样芽
孢杆菌的MPN值/g,并作出报告。
7 证实试验
7.1 形态观察
取营养琼脂斜面培养物,作革兰氏染色镜检。蜡样芽孢杆菌为革兰氏阳性大杆菌,呈
短链或长链,芽孢呈椭圆形位于菌体中央或偏端,不使菌体胀大。
7.2 生化学性状
7.2.1 葡萄糖发酵试验
接种于酚红葡萄糖肉汤中,厌氧条件下35℃培养24h。培养基应由红色变为黄色(表明
本菌在厌氧条件下分解葡萄糖产酸)。
7.2.2 硝酸盐还原试验
接种于硝酸盐肉汤中,35℃培养24h。加硝酸盐试剂后应为阳性反应(红色)。
7.2.3 V-P试验
接种于改良V-P培养基中,35℃培养48 h。加V-P试剂及肌酸数粒,静止1h,应为阳性
反应(伊红色)。
7.2.4 L-酪氨酸分解试验
接种于L-酪氨酸琼脂培养基上,35℃培养48 h,阳性反应菌落周围培养基应出现澄清
透明区(表示产生酪蛋白酶)。阴性时应继续培养72 h再观察。
7.2.5 溶菌酶试验
用直径2mm接种环取纯菌悬液一环,接种于溶菌酶肉汤中,35℃培养24h。该菌在本培
养基(含0.001％的溶菌酶)中能生长。如出现阴性反应,应继续培养24 h。
7.2.6 卵磷脂酶试验
接种于MYP琼脂平板上,35℃培养24 h。阳性反应菌落周围应出现沉淀环(表示产生卵
磷脂酶)。
7.3 蜡样芽孢杆菌与类似菌的鉴别试验
7.3.1 动力试验
用接种针挑取培养物穿刺接种于动力培养基中,30℃培养24h。有动力蜡样芽孢杆菌
应沿穿刺线呈扩散生长,而蕈状芽孢杆菌常常呈绒毛状生长,形成所谓的蜂巢状扩散。也
可用悬滴法检查。蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌通常运动极为活泼,而炭疽杆菌则不运
动。
7.3.2 根状生长试验
用接种环取培养物接种于营养琼脂平板上,30℃培养18～24h。蜡样芽孢杆菌群的多
数菌株形成粗糙的似毛玻璃状或融蜡状的菌落。其中唯独蕈状芽孢杆菌则形成根状生长
的特征。
7.3.3 溶血试验
取培养物接种于胰酪胨大豆羊血琼脂平板上,30～32℃培养24h。蜡样芽孢杆菌落周
围呈现β型完全溶血的溶血环。苏云金芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌呈现弱的溶血现象,而
炭疽芽孢杆菌通常为不溶血。
7.3.4 蛋白质结晶毒素试验
取经30℃培养24h并于室温放置2～3d的营养琼脂培养物少许于载玻片上,滴加蒸馏
水混涂成薄膜。经自然干燥,微火固定后,于涂膜加甲醇半分钟后倾掉,再通过火焰干燥,
于载片上滴满0.5％碱性复红液,放火焰上加热微见蒸气(勿使染液沸腾)后持续1.5min,
移去火焰,使载片放置0.5min再倾去染液。用洁净自来水彻底清洗、晾干、镜检。观察
有无游离芽孢和染成黑色的菱形毒素结晶体。如发现游离芽孢形成的不丰富,应将培养
物置室温2～3d再行检查。苏云金芽孢杆菌用此法检测为阳性,而蜡样芽孢杆菌群的其
他菌种则为阴性。
7.3.5 结果解释及报告
符合蜡样芽孢杆菌群的特征,有活泼的动力,很强的溶血能力,不形成根状生长和不
产生蛋白结晶毒素,可报告为蜡样芽孢杆菌。
对偶尔遇到的一些少数可疑菌株,可以根据需要进行其他试验,如青霉素酶、噬菌
体试验等。
附 录 A
培 养 基 制 备
(补充件)
A1 甘露醇卵黄多粘菌素琼脂培养基(MYP)
a. 基础琼脂
牛肉膏 1.0g
蛋白胨 10.0g
D-甘露醇 10.0g
氯化钠 10.0g
琼 脂 15.0g
酚 红 0.025g(配成溶液加入)
蒸馏水 稀释至900mL
b. 50％卵黄液 50mL
c. 多粘菌素B 100 IU/mL
将a.中的前5种成分加入蒸馏水中加热溶解,校正pH至7.2±0.1,加入酚红溶液,混匀
后分装烧瓶中,每瓶225 mL。121℃高压灭菌15min。用时加热溶化,冷至50℃后每瓶加入
50％卵黄液12.5mL和2.5mL多粘菌素B溶液,混匀后倾注灭菌平皿,每皿15～18mL。用前应
将平板置室温约24 h。
注：①50％卵黄液：取鲜鸡蛋,用硬刷将蛋壳彻底洗净,沥干,放于70％酒精溶液中
浸泡1 h。以无菌操作取出卵黄,加入等量灭菌生理盐水,混匀后备用。
②多粘菌素B溶液：在50mL灭菌蒸馏水中溶解500 000国际单位的无菌硫酸盐多
粘菌素B。
A2 胰酪胨大豆多粘菌素肉汤
胰酪胨 17.0g
植物胨 3.0g
氯化钠 5.0g
磷酸氢二钾 2.5g
葡萄糖 2.5g
蒸馏水 稀释至1000mL
pH7.3±0.1
将上述各成分溶解在蒸馏水中,煮沸2min,分装大试管,每管15 mL,121℃高压灭菌
15min。临用时每管加入0.5％多粘菌素B溶液0.1mL混匀即可。
注：多粘菌素B溶液：在33.3mL灭菌蒸馏水中溶解500 000国际单位无菌硫酸盐多粘
菌素B。
A3 酚红葡萄糖肉汤
(月示)胨 10.0g
牛肉膏 1.0g
氯化钠 5.0g
葡萄糖 5.0g
酚 红 0.018g(配成溶液加入)
蒸馏水 稀释至1000mL
pH7.4±0.1
将除酚红外的各成分溶解于蒸馏水并稀释至1000mL。校正pH后加入酚红溶液,混匀,
分装试管,每管3 mL。121℃高压灭菌10min备用。最终pH7.4±0.1
A4 硝酸盐肉汤
牛肉膏 3.0g
蛋白胨 5.0g
硝酸钾 1.0g
蒸馏水 稀释至1000mL
pH7.0±0.1
将上述各成分溶解于蒸馏水并稀释至1000mL。校正pH后分装试管,每管5mL,121℃高
压灭菌15min。
A5 营养琼脂
牛肉膏 3.0g
蛋白胨 5.0g
琼 脂 稀释至1000mL
pH7.2±0.1
将各成分于蒸馏水中加热溶解。校正pH后分装试管,每管5～7mL；或分装烧瓶,每瓶
100～150mL。121℃高压灭菌15 min。将试管取出,制成斜面；如制平板,可将灭菌的琼
脂冷至45～50℃倾注灭菌平皿,每皿18～20mL。
A6 L-酪氨酸营养琼脂
营养琼脂 100mL
5％灭菌L-酪氨酸悬液 10mL
将100mL营养琼脂溶化,冷至45℃,加入5％的灭菌L-酪氨酸悬液10mL,充分混匀后,
分装试管,每管3.5mL。制成的斜面应迅速冷却防止L-酪氨酸分离而出。
注：L-酪氨酸悬液：将0.5g酪氨酸加10mL蒸馏水混匀,121℃高压灭菌15min。
A7 溶菌酶营养肉汤
牛肉膏 3.0g
蛋白胨 5.0g
蒸馏水 稀释至1000mL
0.1%溶菌酶溶液 10.0mL
pH6.8±0.1
将上述成分(溶菌酶溶液除外)溶解于蒸馏水并稀释至1000mL。校正pH后,分装于烧
瓶中,每瓶99mL。121℃高压灭菌15min。于每瓶中加入0.1％溶菌酶溶液1mL,混匀后分装
灭菌试管,每管2.5mL。
注：溶菌酶溶液：在65mL灭菌的0.1mol/L盐酸中加0.1g溶菌酶。煮沸20min溶解后,
再用灭菌的0.1mol/L 盐酸稀释至100mL。
A8 改良 V-P培养基
(月示)蛋白胨 7.0g
葡萄糖 5.0g
氯化钠 5.0g
pH6.5±0.1
将上述各成分溶解于蒸馏水并稀释至1000 mL。校正pH后分装试管,每管5mL。121℃
高压灭菌10 min备用。
A9 动力培养基
胰酪胨 10.0g
酵母膏 2.5g
葡萄糖 5.0g
磷酸氢二钠 2.5g
琼 脂 3.0g
蒸馏水 稀释至1000mL
pH7.4±0.2
将上述各成分于蒸馏水加热溶解并稀释至1000 mL。校正pH后,分装试管,每管2mL。
121℃高压灭菌10 min备用。
A10 胰酪胨大豆羊血琼脂(TSSB)
胰酪胨 15.0g
植物胨 5.0g
氯化钠 5.0g
琼 脂 15.0g
蒸馏水 稀释至1000mL
pH7.0±0.2
将上述各成分于蒸馏水中加热溶解。校正pH后,分装烧瓶,每瓶100mL。121℃高压灭
菌15min。水浴中冷至45～50℃加入5mL无菌脱纤维羊血,混匀后倾注平板,每皿18～20mL。
附 录 B
试 剂 配 制
(补充件)
B1 Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液
在500mL蒸馏水中溶解磷酸二氢钾(KH2PO4) 34.0g,用1mol/L氢氧化钠溶液约175mL校
正pH至7.2,再用蒸馏水稀释至1000 mL,制成储存液于冰箱中储存。取原液1.25mL,用蒸
馏水稀释至1000 mL。分装试管,每管90 mL,121℃高压灭菌15 min。
B2 亚硝酸盐试剂
a. 试剂A：对氨基苯磺酸8.0g,溶解于5mol/L,乙酸1000 mL中。
b. 试剂B：α-萘酚2.5g溶解于5mol/L乙酸1000 mL中。
B3 V-P试剂
a. 5％α-萘酚溶液：取α-萘酚5.0g溶解于100 mL无水乙醇中。
b. 40％氢氧化钾溶液：将氢氧化钾40 g于蒸馏水中溶解并稀释至100 mL。
c. 肌氨酸结晶。
B4 碱性复红染色液
取碱性复红0.5g溶解于20mL乙醇中,再用蒸馏水稀释至100mL,滤纸过滤后储存备用。
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