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植物组培的操作技术:灭菌和接种(1)



录入时间:2011-12-26 10:25:45 来源:互联网

 

一、灭菌

1有菌范畴:凡是暴露的物体,接触水源的物体,其表面都有菌。依此未处理的无菌室、超净台表面、未灭菌的培养基、容器表面、接种刀剪、身体外表及呼吸道等,都是有菌的。

2菌的种类及特点:包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其它微生物。其特点是:极小,肉眼看不见。无处不在,无时不有,无孔不入。忍耐力(热、射线、酸碱、有毒药剂等)强,生活要求简单,繁殖力极强。

3无菌范畴:经高温灼烧或一定时间蒸煮等物理方法处理,或化学药剂处理,高层大气、岩石内部、健康组织内部,强酸强碱,化学元素灭菌剂等。无菌世界要比有菌世界小得多。

4灭菌:指用理化方法,杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体,即把所有生命的物质全部杀死。

5消毒:指杀死、消除或充分抑制部分微生物,使之不再发生危害作用,即一些不会完全杀死,还有活着的微生物。

6无菌操作:在通过严格灭菌的操作空间(接种室、超净台等)和使用的器皿内,以及操作者外表都不带任何活着的微生物条件下,进行操作叫做无菌操作。

7组培无菌的要求:必须彻底无菌,比微生物培养还严格,因为培养基营养丰富,温度和湿度等合适。要彻底灭菌,必须根据不同的对象采取不同的切实有效的方法灭菌。

8灭菌方法可分为物理的和化学的两类:

(1)物理方法:如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(超声波、微波)、过滤、清洗和无菌水冲洗等措施。

(2)化学方法:升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精等。

一.培养基用湿热灭菌 

培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序。

1高压灭菌原理:在0.1MPa的压力下,锅内温度达121。可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。

    2保证高压:1)注意完全排除空气,常用方法是:关闭放气阀,通电后,待压力上升到0.05MPa时,打开放气阀,放出空气,待压力表指针归零后,再关闭放气阀。2)保压到位,维持压力0.10.15MPa 20min。

因容器不同,保压时间而不同

4-1培养基高压蒸气灭菌所必需的最少时间

容器的体积(ml

在121C灭菌所需最少时间(min

20~50

15

75~150

20

250~500

25

1000

30

 

培养基要严格遵守保压时间,既要保压彻底,又要防止培养基中的成分变质或效力降低,不能随意延长时间。

3对其它物品灭菌:无菌水、栽培介质、接种用具、滤纸、实验服、口罩等,可以延长灭菌时间或提高压力。这些物品用耐高压塑料袋装好,或用引报纸或牛皮纸包好。

4引起变化:培养基pH值下降0.20.3 单位。培养基中成分单一时pH值变化幅度较大,甚至可大于2pH单位;升高渗透压:因铁使蔗糖水解为单糖,占15%~25%,约升高0.43倍。PH值小和加入活性碳,蔗糖水解增加。

.无菌操作器械采用灼烧灭菌

对镊子、剪子、解剖刀、瓶口等用灼烧灭菌。若浸入95%的酒精中,然后再灼烧,效果更好。灼烧要完全彻底。

.玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌

1原理:利用烘箱加热到160180C的温度来杀死微生物,通常采用170C持续90min来灭菌。由于在干热条件下,细菌的营养细胞的抗热性大为提高,接近芽孢的抗热水平,

2处理:先洗净并干燥,对工具等要用耐高温的塑料妥为包扎;灭菌时应渐进升温;烘箱内放置的物品的数量不宜过多;到时断电要待充分冷凉,

3特点:耗能源,费时间。成本较低。

 

   四 不耐热的物质采用过滤灭菌

1适用种类:赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素由于不耐热,可用过滤法。

2过滤方法:防细菌滤膜的网孔径为0.45μm以下,细菌的细胞和真菌的孢子等因大于孔径而被阻,液量大时,常使用抽滤装置;液量小时,可用注射器。

 

 

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