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植物病毒的负染技术



录入时间:2011-11-7 14:56:53 来源:互联网

一.目的 
    负染方法是在分子水平上阐明病毒质粒细微结构的一种常用方法,在电镜生物样品制备中以快速、简便、用量少和反差大效果好而成为一项普遍应用的重要方法。通过几种负染法的实验,初步掌握病毒病的快速诊断方法。

二.基本原理

    高密度重金属盐类染色剂对蛋白质不能染色,因此可在病毒粒子周围的背景处沉积下来,造成很强的电子散射而形成较暗的背景,病毒粒体易被电子束穿透成为亮的物体,如同照片的底片(负片)一样,这种染色方法被称为负染。

三.主要仪器、用具及药剂

仪器:电镜、超净工作台、温箱、冰箱、万分之一天平、酸度计、显微镜。
药剂:磷钨酸、醋酸双氧铀、戊二醛、冰乙酸、聚乙烯醇缩甲醛(Formvar)、氯仿(三氯甲烷)、无水乙醇、双蒸水。
用具:载玻片、工具盒,铜网、镊子、单面刀片、手术剪、滴管、Parafilm膜、蜡片、培养皿、滤纸,小烧杯,白瓷盘、滴瓶及蒸溜水、圆头玻棒、250 目铜网、平底皿、卡片纸、5ml量筒、玻璃条、铅笔。

三.实验材料

    提纯的烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)或其它提纯病毒,病毒侵染的病叶

四.实验步骤

    (一).提纯病毒的负染色

  第一种方法:

1.将提纯的TMV悬液用蒸馏水进行1:10或1:100的稀释;
2.用镊子夹持铜网,滴管吸取样品加在铜网上,稍待片刻,用滤纸片从铜网边缘吸掉余液;

3.待铜网上的液体将干未干时,立即滴一滴2-3 %磷钨酸负染色液,注意不能使铜网背面粘上液体。1~2分钟后,用滤纸吸掉余液,自然干燥;
                                          o
4.将染好的铜网放在培养皿中,作好记录,37  C温箱中干燥0.5~1小时即可进行电镜观察。

第二种方法:

1.将提纯的CMV悬液与1%戊二醛固定液按10:1比例在蜡片上混合(戊二醛最终浓度为0.1%),固定10~15分钟;
2.用镊子夹持铜网,沾取样品悬液,稍待片刻;
3.用滴管吸取双蒸水,连续洗滴铜网,洗掉戊二醛固定液等,清洗完毕后用滤纸吸掉余液。
4.待铜网上液体将干未干时,漂浮在1%醋酸铀或3 %磷钨酸负染色液滴上,1~2分钟后取出铜网,用滤纸吸掉余液。 
5.将染好的铜网放在培养皿中,37 ℃温箱中干燥0.5~1小时即可。

   (二).植物病毒浸出法负染色

第一种方法:

1.在载玻片上滴一滴双蒸水或0 ·005M磷酸缓冲液;
2.将一小片植物病叶放置于液滴中并用刀片切碎,让病毒释放到液滴中;
3.夹持铜网,沾取浸出液,稍待片刻,用滤纸吸掉余液;
4.再如上述相同方法进行染色。

第二种方法:

1.将凹玻片中加几滴双蒸水或2 %磷钨酸负染色液;
2.取一小片植物病组织剪碎并在液滴中充分研细;
3.吸液滴到载玻片;
4.用镊子夹持铜网倒扣到载片玻璃上,然后按上述相同方法进行染色。若浸出液中植物残渣过多,可先用双蒸水对铜网滴洗后再进行负染色。也可将组织浸出液经低速离心(2000~4000rpm)后,沾取上清液进行染色。)

第三种方法:
1.在取材前一天,将供试材料浇足水分。取材时选有代表性的病叶剪下,将几张病叶重叠到一起,一手捏紧,另一手持锋利刀片,将几张叶片同时割破,此时破口处将有汁液渗出。
2.用尖细镊子夹住带膜铜网,使膜面朝向破口处,轻轻沾取汁液至铜网上
3.待铜网汁液将干未干时,将吸取负染液的毛细管呈45o角插入镊子两臂的间隙中间,
轻而慢地滴加负染液。使染液经过带膜铜网上而随即流逝。
4.待铜网上染液停留3~5分钟,吸去余液。
5.37℃温箱中干燥0.5~1小时后电镜观察。

 

 

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