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枯草芽孢杆菌培养生产农用抗真菌素初步研究(二)



录入时间:2011-9-28 17:36:52 来源:豆丁网

2 结果与分析
 
2.1生长曲线
    生长曲线实验每隔12h 取发酵液3 瓶,于600nm波长下测量 OD 值,绘制成曲线,结果见图1。
    由图1可知,接种时培养液的 OD 值为 0.175,培养到12h 时OD值为1.78,细菌生物量增长了 9 倍多,到24 h 时 OD值为3.01,细菌生物量增长了16倍多,此期间细菌生物量的增加速度很快,生长属于对数生长期;培养时间在24 ~ 36 h 之间时,细菌生物量基本保持不变,为生长稳定期;培养36 h之后细菌开始死亡,细菌生物量随着时间推移逐渐减少,进入衰亡期。
 
2.2 培养时间对抗真菌素积累的影响
    每隔12 h 取发酵液3 瓶,以 6000r/min 离心15 min,吸取上清液,进行抗真菌效果实验,结果见表1。由表1可以看出,刚接种的培养液在离心之后,尽管含有少量种子液,但其抗真菌素浓度太低,不足以抑制真菌生长,因此在平板上看不到抑菌圈;随着发酵时间的延长,抗真菌素不断累积,到48 h 时发酵液的抗菌活性最强,抑菌圈直径达12.8 mm;之后抗真菌素活性逐渐减小,到96 h 时抑菌圈直径仅为8.8 mm。由实验结果可知,供试菌株发酵生产抗真菌素的最佳时间为培养48 h。
 
2.3 装液量对抗真菌素积累的影响
    在250 mL三角瓶中分别装入 25、50、100、150、200 mL发酵液,研究装液量对抗真菌素积累的影响,结果见表2。由表2 可知,在相同体积的三角瓶中,装液量较少时,其溶氧系数较高,枯草杆菌产生抗真菌素
也较多,其中装液量为50 mL 时,抗真菌素积累较多,抑菌圈直径达14 mm。说明装液量50 mL 对抗真菌素积累的影响最大。
 
2.5 不同碳源对抗真菌素积累的影响
    以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、D-半乳糖和可溶性淀粉6种物质为实验碳源,质量浓度均为0.5%,研究不同碳源对抗真菌素积累的影响,结果见表4。由表4可知,枯草芽孢杆菌BS - 06 生产抗真菌素的最佳碳源为麦芽糖,抑菌圈直径达14.0 mm;其次为葡萄糖,抑菌圈直径为11.5 mm。
 
2.6 麦芽糖浓度对抗真菌素积累的影响
    枯草芽孢杆菌BS - 06在麦芽糖质量浓度分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%时,对发酵生产抗菌物质的影响结果见表5。由表5可知,发酵液的抗真菌活性在麦芽糖浓度为2%时最高,抑菌圈直径为14.6 mm。其他几种麦芽糖浓度处理的抗真菌素活性基本接近。
 
2.7 不同氮源对抗真菌素积累的影响
    选用牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵和硝酸钾6种物质为实验氮源,牛肉膏、酵母膏、蛋白胨浓度为0.5%,硫酸铵、硝酸铵和硝酸钾的浓度为0.1%,考察它们对抗真菌素积累的影响,结果见表6。由表6可以看出,牛肉膏、酵母膏、蛋白胨和硝酸钾都可以被枯草芽孢杆菌BS - 06 利用,并能产生抗真菌素,其中硝酸钾为最佳氮源,抑菌圈直径可达12.2 mm,可能是K+能够提高抗真菌素的活性;硫酸铵、硝酸铵则对BS - 06产抗真菌素不利,可能是由于NH4+,抑制了抗真菌素的活性。
 
2.8 硝酸钾浓度对抗真菌素积累的影响
    研究了枯草芽孢杆菌BS - 06在硝酸钾质量浓度分别为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%和0.25%时,对发酵生产抗菌物质的影响,结果见表7。由表7可以看出,硝酸钾浓度在0.05% ~ 0.2%的范围内,抗菌物质的活性随硝酸钾浓度升高而增大,最大抑菌圈直径达15.5 mm;而硝酸钾浓度超过0.2%时,抗菌物质的活性则下降,抑菌圈直径仅仅为9.8 mm。
 
2.9 不同浓度吐温- 80对抗真菌素积累的影响
    在培养基中添加不同浓度的非离子型表面活性剂吐温- 80,结果发现0.1%、1%、10% 3种浓度均能促进抗真菌素的活性,抑菌圈直径分别为14.3、15.8、14.3 mm,其中以1%的浓度最佳,抑菌圈直径比不添加吐温- 80的对照(12.2 mm)增加近30%。这可能是因为吐温80与枯草杆菌的细胞膜相互作用,增加了细胞膜的通透性,从而增加了抗真菌素向细胞外分泌的量。
 
2.10 抗真菌素的抗菌谱检验
    在上述优化条件下,研究了抗真菌素对节瓜枯萎病菌、冬瓜枯萎病菌、苦瓜枯萎病菌、稻瘟病菌的抗菌效果,结果5种致病菌的抑菌圈直径分别为18.0、19.3、15.3、11.3、11.5 mm。可见,枯草芽孢杆菌BS - 06发酵产生的抗真菌素除了对水稻纹枯病菌具有良好的抗菌性外,对其他4种真菌均有较强的抑菌作用,有望开发成为生物农药,应用于农作物的真菌病害防治。
 
3 结语
    本研究通过一系列单因素实验,确定了枯草芽孢杆菌的最佳发酵条件为:培养时间48 h,装液量为50 mL,初始pH值为8.0,培养基中添加2%麦芽糖、
0.2%硝酸钾和1%吐温 - 80。枯草杆菌BS - 06产生的抗真菌素具有较广的抗菌谱,对水稻纹枯病菌、稻瘟病菌、节瓜枯萎病菌、冬瓜枯萎病菌、苦瓜枯萎病菌均有较好的抗菌效果,有望开发成生物农药来防治农作物病原真菌。
本研究的后续研究工作拟对该抗真菌素进行分离纯化和结构鉴定,以及对其性质进行研究,以期为该抗真菌素在农作物真菌病害防治上的应用提供依据。
 
参考文献:
[1] 余凤玉,李振华,曾会才.抗真菌农用抗生素的研究进展[J].热带农业科学,2005,25(1):61-66.
[2] 李巧丽,袁月星.抗植物真菌病害基因及其应用[J]" 生物学教学,2000,25(12) :2-4
[3] 蒋琳,马承铸.生物农药研究进展(综述)[J].上海农业学报,2000,16(增刊):73-77
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