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龙胆泻肝丸微生物限度检查方法验证



录入时间:2011-9-21 16:31:36 来源:中国论文下载中心

【摘要】  目的:建立一种龙胆泻肝丸微生物限度检查方法。方法:采用药典规定的常规法和稀释法,通过验证确认所采用的方法是否适合于*该药品的细菌、霉菌和酵母菌、控制菌的检查。结果:细菌、霉菌和酵母菌方法验证中回收率在70%以上;控制菌方法验证中阳性对照菌检出,阴性对照菌未检出。结论:龙胆泻肝丸微生物限度检查法的细菌、霉菌和酵母菌数可以采用常规法或稀释法进行检查,控制菌检查可以采用常规法检查。

【关键词】  微生物限度; 验证

当建立药品的微生物限度检查时,应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证,以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌的测定。验证试验可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。

  1 实验材料

  1.1 培养基

  营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、胆盐乳糖发酵培养基、营养肉汤培养基、改良马丁液体培养基、改良马丁琼脂培养基、MUG培养基、靛基质试液。

  1.2 菌种

  大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、 金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]。

  1.3 供试品

  龙胆泻肝丸。

  2 菌液的制备

  2.1 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌液制备

  取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的营养琼脂斜面培养物接种于10ml营养肉汤培养基中,35~37℃培养18~24小时;取培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml,采用10倍递增稀释法,稀释至10-6或10-7,制成每1ml含菌数50~100cfu的菌悬液。

  2.2 白色念珠菌菌液制备

  取白色念珠菌的改良马丁琼脂斜面培养物接种于10ml改良马丁培养基中,23~28℃培养24~48小时;取培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml,采用10倍递增稀释法,稀释至10-6或10-7,制成每1ml含菌数50~100cfu的菌悬液。

  2.3 黑曲霉菌液制备

  取黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中,23~28℃培养5~7天,加入3~5ml0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱,吸至无菌试管中,取1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml,采用10倍递增稀释法,稀释至10-4~10-6,制成每1ml含孢子数50~100cfu的孢子悬液。

  3 供试液的制备

  取供试品10g,加pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml,用匀浆仪混匀,作为1:10供试液。

   4 回收率测定

    4.1.1 试验组

  (1)常规法:取1:10供试液1ml、菌液(10-6约50~100cfu)1ml,分别同时注入于平皿中,做10个平皿;立即倾注营养琼脂培养基,待凝固后,置30~35℃培养48小时,逐日观察结果。(2)稀释法:取1:10供试液1ml等量分注入于5个平皿中,每个平皿加试验菌 (10-6约50~100cfu)1ml,立即倾注营养琼脂培养基,待凝固后,置30~35℃培养48小时,逐日观察结果。

  4.1.2 菌液组 取上述试验菌液,测定每一菌株所加的试验菌菌数。采取平皿法,取试验用的菌液(10-6约50~100cfu)1ml,分别注入平皿中,立刻倾注培养基,每株试验菌平行制备2个平皿,按平皿法测定其菌落数。

  4.1.3 供试品对照组 (1)常规法:取1:10供试液1ml注入于平皿中,做2个平皿;立即倾注营养琼脂培养基,待凝固后,置30~35℃温度培养48小时,逐日观察结果。(2)稀释法:取1:10供试液1ml等量分注于5个平皿中,立即倾注营养琼脂培养基,待凝固后,置30~35℃培养48小时,逐日观察结果。

  4.2 霉菌、酵母菌回收率测定

  4.2.1 试验组 取1:10供试液1ml、菌液(10-6约50~100cfu)1ml,分别同时注入于平皿中,立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基,待凝固后,置23~28℃培养72小时,逐日观察结果。

  4.2.2 菌液组 同4.1.2。

  4.2.3 供试品对照组 取1:10供试液1ml注入于平皿中,立即倾注玫瑰红钠培养基,待凝固后,置规定温度培养72小时,逐日观察结果。

  4.3 细菌、霉菌和酵母菌计数及验证结果

  表1 细菌、霉菌和酵母菌计数及方法验证的试验 以上数据为3次试验结果(注:稀释法中枯草芽孢杆菌回收率不易达到70%)。

  5 控制菌方法的验证

  取2瓶100ml胆盐乳糖培养基,分别加入1:10供试液各10ml,其中1瓶加入大肠埃希菌液1ml,另1瓶加入金黄色葡萄菌液1ml,置35~37℃培养24小时,分别取上述培养液0.2ml接种于5mlMUG培养基中,培养于5小时、24小时在366nm紫外线下观察,观察后,沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液。试验重复3次(表2)。表2 控制菌检查方法验证试验结果

  6 讨论

  由表1结果看出,细菌、霉菌和酵母菌试验组的回收率在70%以上,说明龙胆泻肝丸微生物限度检查法的细菌数和霉菌、酵母菌数可以采用常规法和稀释法两种方法中的任一种进行测定。由表2结果可以看出,阳性对照菌检出,阴性对照菌未检出,说明龙胆泻肝丸控制菌检查可以采用常规法测定。

参考文献
   1国家药典委员会编.中华人民共和国药典.北京:化工工业出版社,2005.

 

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