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组织培养时各种灭菌特点(四)



录入时间:2011-8-26 15:52:55 来源:中国生命科学实验

7、植物材料表面用消毒剂灭菌

从外界或室内选取的植物材料,都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养基,便会造成培养基污染。因此,植物材料必须经严格的表面灭菌处理,再经无菌操作手续接种到培养基上,这一过程叫做接种。接种的植物材料叫做外植体(explant)。

首先,将采来的植物材料除去不用的部分,将需要的部分仔细洗干净,如用适当的刷子等刷洗。把材料切割成适当大小,即灭菌容器能放入为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时,冲洗时间视材料清洁程度而宜。易漂浮或细小的材料,可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重时特别有用。

洗时可加入洗衣粉清洗,然后再用自来水冲洗洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物,除去脂质性的物质,便于灭菌液的直接接触。当然,最理想的清洗物质是表面活性物质吐温。

第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成,准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。用70%酒精浸10-30秒。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用,加之70%酒精穿透力强,也很易杀伤植物细胞,所以浸润时间不能过长。有一些特殊的材料,如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗,多层鳞片的休眠芽等等,以及主要取用内部的材料,则可只用70%酒精处理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下,待酒精蒸发后再剥除外层,取用内部材料。

第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多,可根据情况选取1-2种使用见下表。

常用灭菌剂使用浓度及效果比较表

灭菌剂名称 使用浓度% 消毒难易 灭菌时间 灭菌效果

酒精 70-75 易 0.1-3 好

氯化汞 0.1-0.2 较难 2-10 最好

漂白粉 饱和溶液 易 5-30 很好

次氯酸钙 9-10 易 5-30 很好

次氯酸钠 2(活性氧) 易 5-30 很好

过氧化氢 10-12 最易 5-15 好

抗菌素 4-50mg/L 中 30-60 较好

上述灭菌剂应在使用前临时配制,氯化汞可短期内储用。次氯酸钠和次氯酸钙都是利用分解产生氯气来杀菌的,故灭菌时用广口瓶加盖较好;升汞是由重金属汞离子来达到灭菌的;过氧化氢是分解中释放原子态氧来杀菌的,这种药剂残留的影响较小,灭菌后用无菌水漂洗3-4次即可;由于升汞液灭菌的材料,难以对升汞残毒去除,所以应当用无菌水漂洗8-10次,每次不少于3分钟,以尽量去除残毒。

灭菌时,不沥干的植物材料转放到烧杯或其他器皿中,记好时间,倒入消毒溶液,不时用玻璃棒轻轻搅动,以促进材料各部分与消毒溶液充分接触,驱除气泡,使消毒彻底。在快到时间之前1-2分钟,开始把消毒液倾入一备好的大烧杯内,要注意勿使材料倒出,氢净后立即倒入无菌水,轻搅漂洗。灭菌时间是从倒入消毒液开始,至倒入无菌水时为止。记录时间还便于比较消毒效果,以便改正。灭菌液要充分浸没材料。宁可多用些灭菌液,切勿勉强在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌。

在灭菌溶液中加吐温-80或Triton X效果较好,这些表面活性剂主要作用是使药剂更易于展布,更容易浸入到灭菌的材料表面。但吐温加入后对材料的伤害也在增加,应注意吐温的用量和灭菌时间,一般加入灭菌液的0.5%,即在100ml加入15滴。

最后一步是用无菌水漂洗,漂洗要求3分钟左右,视采用的消毒液种类,漂洗3-10次左右。无菌水漂洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。

 

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