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病毒学实验技术(5)



录入时间:2011-8-10 8:48:55 来源:百度

 

细胞的制备

应用细胞种类很多,兹以原代猪肾细胞为例。

(一)无菌取胚胎或仔猪肾。

(二)去肾被膜,切开肾为两半,剪去肾盂及髓质部。

(三)以含青霉素各200单位/ml的磷酸盐缓冲盐水洗去血球,用剪刀剪成约小米粒大的小块,移于灭菌三角瓶中。

(四)再用含抗菌素的磷酸盐缓冲液洗34次至洗液彻底清亮为止。

(五)加入34倍以上体积的35胰酶液,在电磁搅拌器上搅拌消化(如无电磁搅拌器可置40水浴锅中,内加无菌玻璃珠摇动),搅拌(或摇振)时以发生旋涡而不起泡沫为度,至液体明显混浊时(约10分钟左右),再用吸管或注射器吹打数次,待组织块沉淀后,将上层被消化后的细胞吸出,再加入消化液,将余下组织块再同样消化于401020分钟,再次吹打,分散细胞,将两次消化液汇合一起,经四层纱布过滤,收集滤液,离心(1500转/分,10分钟),弃上清液,加入含抗菌素的(见前述)汉克斯氏液悬浮,再离心,弃上清,加入营养液(见下述)悬浮,再离心。

亦可将组织块在4下消化1624小时(所谓冷消化法),搅拌,吹打,收集细胞液,离心,同上述。

(六)末次离心后,弃上液,加入少许营养液悬浮,用计算白血球的方法计算每毫升中细胞数,计数发现细胞太多时可取少许浓细胞液加营养液适当稀释后再计。

 (七)根据计数结果,以营养液稀释到每毫升含肾细胞100万个。有经验的工作人员,可以不计数,稀释细胞到适当的混浊度即可。

营养液:取10 ml小牛血清,80ml汉克斯氏液和10 ml  5%乳蛋白水解物配成营养液,加双抗使每ml营养液中含青、链霉素各200单位。青、链霉素事先可配成各20000单位/ml的溶液。

(八)分装于小玻瓶(小型实验室可用空的链霉素瓶,洗净,灭菌)中,链霉素瓶装1ml,并以蜡笔作瓶的上下记号。

平放静置37孵育两天后,每日检查,至长成单层为度,快则23天,慢则67天。如液体混浊说明有细菌生长,并往往变酸或有霉菌生长时,应废弃。

(九)换液加病毒

长成单层后,吸弃营养液,加入9ml维持液。维持液中血清含量比营养液少一半(抗菌素含量同上)。接种含病毒的材料0.1ml,放回温箱再培养。

(十)观察及收获病毒  每日检查一次,凡有霉菌及细菌生长者弃之。病毒在其中生长,可引起细胞变性,原生质出现颗粒状,核浓缩或裂解,有的还明显的引起细胞溶解,出现空斑。发现有细胞变化或空斑时,即可将液体收集保存,同时做无菌检验。所收集的液体即繁殖的病毒液。有的病毒在细胞培养上生长,但细胞不出现病变,此时应以其它方法检查,如回归动物、END法、荧光抗体检查等等。

瓶上细胞检查可作为一个标本保存,即吸去内溶液以后,经甲醇固定,姬姆萨液染色,水洗,干燥后保存。

传代细胞比初代细胞易于操作,在玻璃器皿内更易于适应,其性能(如所用的或可用的培养液、细胞的形态、细胞生长速度、细胞的保存等)是知道的,故较原代细胞常用。兽医实验诊断室最好备有传代细胞,以便于从事病毒病的微生物学诊断。

 

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