真菌分离培养应考虑所分离真菌的特性，配制合适的培养基，选择所需的气体环境。同时, 由于真菌分离材料常污染有大量细菌，所以可在培养基中加入抗菌素并在分离培养过程中严格执行无菌操作。

目的要求

1．掌握真菌分离培养方法。

2．认识真菌菌落的特征，比较与细菌菌落有何不同。

3．了解真菌载片培养法。

4．掌握观察真菌的基本方法，并观察其形态特征。

操作步骤

—、真菌的分离培养方法

（－）平板划线分离法

1．取适合真菌的琼脂培养基融化，冷至45℃，注入无菌平皿中，每皿15～20ml，制成平板待用。

2．取要分离的材料（如田土、混杂的或污染的真菌培养物、真菌）少许，投入盛无菌水的试管内，振摇，使分离菌悬浮于水中。

3．将接种环经火焰灭菌并冷却后，蘸取上述菌悬浮液，进行平板划线(同细菌的划线法)。

4．划线完毕，置温箱中培养2～5d，待长出菌落后，钓取可疑单个菌落先作制片检查，若只有一种所需要的真菌生长，即可进行钓菌纯培养。如有杂菌可从单个菌落中钓少许菌制成悬液，再作划线分离培养，有时需反复多次，才得纯种。另外，也可在放大镜的观察下，用无菌镊子夹取一段待分离的真菌菌丝，直接放在平板上作分离培养，可获得该种真菌的纯培养。

（二）稀释分离法

1．取盛有无菌水的试管5支（每管9ml），分别标记1、2、3、4、5号。取样品（如田土等）1g，投入1号管内，振摇，使悬浮均匀。

2．用1ml灭菌吸管，按无菌操作法，从1号管中吸取1ml悬浮液注入2号管中，并摇匀；同样由2号管取1ml至3号管，依此类推，直至5号管。注意每稀释一管应更换一支灭菌吸管。

3．用2支无菌吸管分别由4号、5号试管中各取1ml悬液，并分别注入2个灭菌培养皿中，再加入融化后冷至45℃的琼脂培养基约15ml，轻轻在桌面上摇转，静置，使冷凝成平板。然后倒置温箱中培养，2～5d后，从中挑选单个菌落，并移植于斜面上。

二．真菌培养性状观察

（一）真菌在固体培养基上的生长表现

1 .酵母菌菌落：酵母菌在固体培养基上多呈油脂状或蜡脂状，表面光滑、湿润、黏稠，有的表面呈粉粒状、粗糙或皱褶。菌落边缘有整齐、缺损或带丝状。菌落颜色有乳白色、黄色或红色等。

2. 霉菌菌落：将不同霉菌在固体培养基上培养2～5d，可见霉菌菌落呈绒毛状、絮状、蜘蛛网状等。菌落大小依种而异，有的能扩展到整个固体培养基，有的有一定的局限性（直径1～2mm或更小）。很多霉菌的孢子能产生色素，致使菌落表面、背面甚至培养基呈现不同的颜色，如黄色、绿色、青色、黑色、橙色等。   

（二）真菌在液体培养基中的生长表现

1. 酵母菌  注意观察其混浊度、沉淀物及表面生长性状等。

2. 霉菌  霉菌在液体培养基中生长，一般都在表面形成菌层，且不同的霉菌有不同的形态和颜色。

    三． 真菌的形态观察

（一）真菌水浸片的制备及观察

常用美兰染色液制备真菌水浸片来观察真菌的菌体形态，并且活细胞能还原美蓝为无色，故可区别死细胞、活细胞。

1. 酵母菌水浸片的制备

将美兰染色液一滴滴加在干净的载玻片中央，如不染色则加蒸馏水一滴，用接触环以无菌操作取培养48h左右的酵母菌体少许，在液滴中轻轻涂抹均匀（液体培养物可直接取一接种环培养液于玻片上）并加盖干净盖玻片。为避免产生气泡，应先将其一边接触液滴，再慢慢放下盖片。然后置于显微镜载物台上进行观察，注意酵母菌的形态、大小和芽体，同时可以根据是否染上颜色来区别死、活细胞。

2. 霉菌水浸片的制备

在干净载玻片上加蒸馏水或美兰染色液一滴。取培养2～5d的根霉或毛霉、培养3～5d的曲霉、青霉或木霉、培养2d左右的白地霉同上法制片。霉菌要选择有无性孢子的菌体，用解剖针挑取少量菌丝体放在载玻片的液滴中，将玻片置于解剖镜下，细心地用解剖针将菌丝体分散成自然状态，然后加盖玻片，注意不要让其产生气泡，盖后不再移动玻片，以免弄乱菌丝。制好片后，就可以在显微镜下观察。

观察时注意它们的菌丝有无隔膜、孢子囊柄与分生孢子柄的形状、分生孢子小梗的着生方式、孢子囊的形态、足细胞与假根的有无、孢子囊孢子和分生孢子的形状和颜色、节孢子的形状和特点等。并且要区别根霉与毛霉、青霉、曲霉、木霉之间的异同点以及白地霉的特点。 

（二）霉菌封闭标本的制备

霉菌的封闭标本，常用乳酸石炭酸液封片，其中含有的甘油使标本不宜干燥，而石炭酸又有防腐作用。在封片液中，还可加入棉蓝或其它酸性染料，以便于观察菌体。

在洁净载玻片上滴一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落的边缘处取少许带有孢子的菌丝于染液中，再细心地把菌丝挑成自然状态，然后用盖玻片盖上，注意不要产生气泡。在温暖干燥室内放数日，让水分蒸发一部分，使盖玻片与载玻片紧贴，即可封片。封片时，先用清洁的纱布或脱脂棉将盖玻片四周擦净，并在盖玻片周围涂一圈加拿大树胶或合成树胶，风干后即成封闭标本。

（三）真菌的载片培养

真菌的载片培养法不仅可克服水浸片制片的困难，还可使对菌丝分枝和孢子着生状态的观察获得更满意的效果。

取直径7cm左右圆形滤纸一张，铺放于一个直径9cm的平皿底部（图5-1），上放一U形玻棒，其上再平放一张干净的载玻片与一张盖玻片，盖好平皿盖进行灭菌。挑取真菌孢子接入盛有灭菌水的试管中，摇振试管制成孢子悬液备用。用灭菌滴管吸取灭菌后融化的真菌固体培养基少许，滴于上述灭菌平皿内的载玻片中央，并以接种环将孢子悬液接种在培养基四周，加上盖玻片，并轻轻压贴一下。为防止培养过程中培养基干燥，可在滤纸上滴加灭菌20％甘油液3～4ml，然后盖上平皿盖，即成所谓湿室载片培养。放在适宜温度（多数真菌为20～30℃）的培养箱内培养，定期取出在低倍镜下观察，可以看到孢子萌发、发芽管的长出、菌丝的生长、无隔菌丝中孢子囊柄与孢子囊孢子形成的过程、有隔菌丝上足细胞生长、锁状联合的发生、孢子着生状态等。

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