染色观察

为了提高观察效果，被观察的对象也要进行处理。开始，微生物学家在用光学显微镜观察细菌的时候，由于悬浮在液体中的细胞既微小又透明，观察起来非常困难。后来发现细胞可以用染料染色，而且不同的细胞结构对不同染料有特异的反应，甚至不同种类微生物对同种染料的着色情况也不同。最著名的例子是丹麦科学家革兰（Chriatian,Gram）在1884年发明的一项重要的观察细菌的方法。

 

这个方法是把细菌涂在载玻片上在酒精灯上烘干，用结晶紫染色，再用碘液处理，然后用酒精浸洗，看细胞是否能保留染料。结果发现有些细菌能保持紫色，另一些却褪色。这种现在仍然在广泛使用的革兰氏染色反应对于细菌的鉴定具有很高的价值，而且后来发现根据这个染色反应区分的革兰氏阳性细菌（能够保留染料，故细菌呈紫色）和革兰氏阴性细菌（不能保留染料而被番红花红染成红色）在许多生理特性上有区别，例如革兰氏阳性细菌对青霉素和磺胺类药物特别敏感。现在知道这是因为两类细菌的细胞壁有很大的差异。

　　用染料染色细菌的方法很多，不同的微生物可以用不同的染料，不同的细胞器官也可以采用不同的染料，例如可以用一种称之为嗜酸染色的方法识别引起麻风的分支杆菌，用印度墨汁染色细菌的荚膜，用孔雀绿染色芽孢，等等。

 

　　除了用各种染料染色样品以便清楚地观察微生物外，后来又发明了用各种可以发荧光的物质来染色微生物样品。例如现在可以用一种荧光染料来区分革兰氏阳性和阴性细菌。

 

电镜样品制备

用电子显微镜观察的样品也要经过认真细致的处理，以至于今天出现了一门非常有用的技术科学—电子显微镜学。电子显微镜观察样品的方法很多，基本上可以分为透射型和扫描型两类。前者是电子流通过观察样品而形成图象；后者则是用来观察微生物的表面细节，分辨率大约在7纳米左右。待观察的样品则必须进行相当复杂的处理，而且有些处理方法是和用光学显微镜观察时很不相同的，因为在进行电子显微镜观察时受到一些特殊限制。首先，由于样品处于高真空环境中，样品必须尽可能保持原状，所以微生物样品要进行固定和脱水处理；第二，要使电子束全部透过样品，所以样品必须尽可能薄；第三，为了便于观察，图象的反差要大，光学显微镜是靠光的吸收差异来达到，而电子显微镜则靠电子散射程度，决定电子散射程度的是元素的质量和厚度，为此常用重金属处理，例如金、铂等处理。

　　投射电子显微镜的观察样品的主要制备方法是：

 

1、投影法。在真空条件下，用电子散射能力强的重金属原子来喷镀样品表面，这样在样品和没有喷镀的区域形成了较强的反差，而没有喷镀的部分成了样品的投影，根据投影我们可以了解样品的立体形状、高度，通常用这种方法来观察细菌的鞭毛或病毒的颗粒。

 

2、负染法。因为这种方法是将样品的背景染色以突显样品，所以称为负染。一般是用电子密度高，本身不会显示任何结构，又和样品不起反应的物质，例如磷钨酸的钠盐将样品包围，同时染色剂还会投入观察对象的内部，这样，既能显示外形，又可在一定程度上反应样品的内部结构。用这种方法可以观察细菌细胞、病毒等。

　　3、超薄切片法。这是最常用的方法，因为可以观察细胞或其它样品内部的细微结构。通常是要按照一定程序对样品进行固定，脱水，然后包埋在树脂中作为支持物，用超薄切片机切成极薄的切片。因为只有在20—100纳米厚度的切片用投射电子显微镜才能观察，所以一般细菌样品，一个细胞要分割成10片到50片。

 

4、冰冻蚀刻法。所谓冰冻蚀刻，是把样品放在-196℃的液态氮中迅速冷冻，然后加温到-100℃，使样品变得非常脆弱易碎，再用预先也冷却到-196℃的非常锋利的玻璃断口切割经冷冻的样品，这样使样品在最容易断裂的部位断开（如果是微生物细胞，则多半是沿内膜中部），然后让样品放在真空条件下升华掉断口处的冰，最后用重金属喷镀该断口表面，即可用电子显微镜观察其结构。用这种制备方法的优点是可以避免在固定、脱水和包埋过程中造成细胞结构的人为改变而形成的假象。

 

　和投射电子显微镜是靠透过物体的电子成像不同，扫描电子显微镜的成像是靠观察物体表面发射的电子。扫描电子显微镜是用聚焦得很细的电子束在样品表面扫描。电子激发样品表面的原子放电，释放出微细的电子簇（二次电子），用灵敏的检测装置可以捕获它们，然后通过类似电视机的原理将样品图象呈现出来。二次电子对检测器的作用取决于样品表面的性质，当电子激发样品表面突起部位时，会有大量二次电子进入检测器，而表面凹陷处则只有少量二次电子进入，所以可以显出反差突出、明暗清晰的三维图象。而且它的成像焦深较长，图象的立体感强，和肉眼所见差别不大。制备扫描电子显微镜的样品也先要经过固定、脱水等处理，以免在真空条件下变形失真，为了获得较多的二次电子，表面要喷涂重金属和碳原子。