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大肠杆菌目标蛋白的诱导及总蛋白检测



录入时间:2011-6-20 15:26:38 来源:互联网

大肠杆菌目标蛋白的诱导及总蛋白检测(含T7表达系统如BL21菌株中的pET系列表达体系):
诱导蛋白表达:
1.取过夜培养物50ul-200ul接种于5ml含抗生素的Universal瓶中
2.37度摇2小时左右
3.取一定体积的菌液做阴性对照,其余的加IPTG至终浓度为0.2mM(可变)(4ml培养基加80mM的IPTG10ul)
4.37度摇2小时左右
检测蛋白表达:
5.取100ul(或更多)培养物,用pH值为7.4的20mM Tris-HCl(或PBS 7.4)浓缩10倍或5倍。(菌体多时也可不浓缩)
6.加等体积的2倍上样液(Sampling Buffer),或1/9体积10倍上样液。(加上样液之前后最好将菌体尽量打散,可防止菌体不能完全破裂,还可加入1M的DTT至终浓度50mM防止加热时二硫键的形成。)
7.100度煮2-4分钟
8.12000rpm,离心1min(菌体破碎完全时也可不做)
9.取上清点样做SDS-PAGE
 
部分试剂:
1.蛋白上样buffer(2倍)(10ml):
SDS 0.2g,溴酚蓝0.0006g,1M Tris-HCl (pH=6.8) 0.8ml,glycerol 1.5ml。
2.蛋白上样buffer(10倍)(10ml):
SDS 1g,1MTris-HCl (pH=6.8)2.5ml,溴酚蓝0.003g,glycerol 4ml。
3.1M DTT(二硫苏糖醇)
3.09g DTT溶于20ml 0.01mol/l 乙酸钠,过滤除菌,分装,-20度储存。
 

 

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