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    大肠杆菌DNA片段凝胶回收



    录入时间:2011-6-20 14:37:26 来源:互联网

    1试剂盒回收 (离心法)
    (1) 在长波紫外灯下切下含有目标DNA的琼脂糖凝胶,用纸巾吸干凝胶表面的液体并切小.计算凝胶的重量,该重量作为一个凝胶体积(如1oomg=1ooul)
    (2) 根据凝胶的浓度,加DE-A 液
    凝胶浓度          DE-A溶液体积
    ≤1.0%             3个凝胶体积
    ≤1.5%              4 个凝胶体积
    ≤2.0%              5 个凝胶体积
    混匀后于75℃加热,(低熔点琼脂糖凝胶于45℃加热),间断混合,直到凝胶熔化(6-8分钟).
    (3)加0.5个DE-A体积的DE-B溶液,混匀(是否需调整PH值,见注意事项1);当分离的DNA片段小与400bp 时,加入异丙醇至终浓度为20%;
    (4)吸3中的混合液,转移到DNA制备管,3600rpm离心1分钟.如制备管中有残留,适当提高速度,再离心1分钟,去滤液;
    (5)将制备管置回离心管,加0.5ml W1溶液,3600rpm离心30,弃滤液;
    (6)将制备管置回离心管,加0.7ml W2溶液,3600rpm离心30,弃滤液,重复一次; (W2中含有酒精,应保证瓶子密封。)
    (7)将制备管置回离心管,最高速度离心1分钟;
    (8)将制备管置洁净的1.5 ml 离心管中,在DNA制备膜正中央加25ul水或洗脱液,室温静置1分钟.最高速度离心1分钟洗脱DNA.
     
    注意事项;
    1.此法适合从TAE或TBE琼脂糖凝胶中回收DNA,用其他缓冲液时,加DE-B溶液后,溶液的PH要调整到6.5以下.
    2. 勿将DNA长时间暴露在高温下,线型DNA于高温条件下易水解.勿将凝胶长时间暴露在紫外灯,减少紫外灯对DNA的损伤.
    3. 2步骤中的凝胶必须完全熔化,否则将严重影响DNA的回收效率.
    4. 步骤4中吸回滤液到DNA制备管中再吸附一次,可提高回收效率.将洗脱液或水加热到60℃,可提高回收效率。(重要)
    5. DNA分子呈酸性,建议在洗脱液中保存。(试剂盒中提供的洗脱液好像对PCR有某种抑制作用。)
     
    2  silica回收
    1 在长波紫外灯下切下含有目标DNA的琼脂糖凝胶, 用纸巾吸干凝胶表面的液体并切小.计算凝胶的重量;
    2.  加入2-3倍体积的6M KI或NaI(避光4度保存);
    1. 65℃温浴, 间断混合,直到凝胶熔化;
    2. 加适量的振匀的silica悬液(10ul)充分混匀, 冰上放置15分钟(或更长),间断混合;
    3. 5000rpm离心3分钟, 弃上清;
    4. 加1ml预冷的NEW buffer(先用100ul打散沉淀,再用900ul混匀),冰上 洗盐2 分钟,间断混合;
    5. 12000 rpm离心10s, 弃上清;
    6. 重复6,7步骤1次;
    7. 于50℃烘箱烘干;
    8. 加10ul的去离子水用枪头打匀,65℃水浴15分钟,间断混匀;
    9. 12000 rpm离心10 s,把上清转移到另外洁净的离心管中;
    10. 跑胶检测回收效率.
     
    注意事项
    * 4----8步均在冰上操作,防止解吸附,silica只在低温下对DNA有吸附作用。
    * NEW Buffer:(100ml)
    1ml 5M Nacl, 1ml 1M pH7.5 This-HCl, 0.5ml 0.5M EDTA, 50ml 100% ETOH, 去离子水加至100ml。(-20度保存)
    * Silica配法见:TIG January 1995 Vol.11 No. 1. An inexpensive alternative to glassmilk for DNA purifyication.

     

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