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新城疫病原分离与鉴定



录入时间:2011-6-16 9:44:52 来源:互联网

当临床诊断有新城疫发生时,应从发病禽或死亡禽采集病料,进行病原分离、鉴定和毒力测定。
1  样品的采集、保存及运输
1.1  样品采集
1.1.1  采集原则。采集样品时,必须严格按照无菌程序操作。采自于不同发病禽或死亡禽的病料应分别保存和标记。每群至少采集5只发病禽或死亡禽的样品。
1.1.2  样品内容
发病禽:采集气管拭子和泄殖腔拭子(或粪便);
死亡禽:以脑为主;也可采集脾、肺、气囊等组织。
1.2  样品保存
1.2.1  样品置于样品保存液(0.01M PBS溶液,含抗生素且pH为7.0~7.4)中,抗生素视样品种类和情况而定。对组织和气管拭子保存液应含青霉素(1000IU/mL)、链霉素(1mg/mL),或卡那霉素(50μg/mL)、制霉菌素(1000IU/mL);对泄殖腔拭子(或粪便)保存液的抗菌素浓度应提高5倍。
1.2.2  采集的样品应尽快处理,如果没有处理条件,样品可在4℃ 保存4天;若超过4天,需置-20℃保存。
1.3  样品运输
所有样品必须置于密闭容器,并贴有详细标签,以最快捷的方式送检(如:航空快递等)。如果在24小时内无法送达,则应用干冰致冷送检。
1.4  样品采集、保存及运输按照《高致病性动物病原微生物菌(毒)种或者样本运输包装规范》(农业部公告第503号)执行。
2  病毒分离与鉴定
2.1  病毒分离与鉴定:按照GB 16550附录A3.3、A4.1、A4.2进行。
2.2  病原毒力测定
2.2.1  最小病毒致死量引起鸡胚死亡平均时间(MDT)测定试验
按照GB 16550附录A4.3进行;
依据MDT可将NDV分离株分为强毒力型(死亡时间≤60小时);中等毒力型(60小时<死亡时间≤90小时;温和型(死亡时间>90小时)。    
2.2.2  脑内致病指数(ICPI)测定试验
收获接种过病毒的SPF鸡胚的尿囊液,测定其血凝价>24,将含毒尿囊液用等渗灭菌生理盐水作10倍稀释(切忌使用抗生素),将此稀释病毒液以0.05mL/羽脑内接种出壳24~40小时的SPF雏鸡10只,2只同样雏鸡0.05mL/羽接种稀释液作对照(对照鸡不应发病,也不计入试验鸡)。每24小时观察一次,共观察8天。每次观察应给鸡打分,正常鸡记作0,病鸡记作1,死鸡记为2(死亡鸡在其死后的每日观察结果都记为2)。
ICPI值=每只鸡在8天内所有分值之和/(10只鸡×8天),如指数为2.0,说明所有鸡24小时内死亡;指数为0.0,说明8天观察期内没有鸡表现临床症状。
当ICPI达到0.7或0.7以上者可判为新城疫中强毒感染。
2.2.3   F蛋白裂解位点序列测定试验
NDV糖蛋白的裂解活性是决定NDV病原性的基本条件,F基因裂解位点的核苷酸序列分析,发现在112~117位点处, 强毒株为112Arg-Arg-Gln-Lys(或Arg)-Arg-PHe117;弱毒株为112Gly-Arg(或Lys)-Gln- Gly-Arg-Leu117 这是NDV致病的分子基础。个别鸽源变异株(PPMV-1)112Gly-Arg-Gln-Lys-Arg-PHe117,但ICPI值却较高。因此,在115、116位为一对碱性氨基酸和117位为苯丙氨酸(PHe)和113位为碱性氨基酸是强毒株特有结构。根据对NDV F基因112-117位的核苷酸序列即可判定其是否为强毒株。 (Arg-精氨酸;Gly-甘氨酸;Gln-谷氨酰胺;Leu-亮氨酸;Lys-赖氨酸)。
分离毒株F1蛋白N末端117位为苯丙氨酸(F),F2蛋白C末端有多个碱性氨基酸的可判为新城疫感染。“多个碱性氨基酸”是指113至116位至少有3个精氨酸或赖氨酸(氨基酸残基是从后F0蛋白基因的N末端开始计数的,113至116对应于裂解位点的-4至-1位)。
2.2.4  静脉致病指数(IVPI)测定试验
收获接种病毒的SPF鸡胚的感染性尿囊液,测定其血凝价>24,将含毒尿囊液用等渗灭菌生理盐水作10倍稀释(切忌使用抗生素),将此稀释病毒液以0.1mL/羽静脉接种10只6周龄的SPF鸡,2只同样鸡只接种0.1mL稀释液作对照(对照鸡不应发病,也不计入试验鸡)。每24小时观察一次,共观察10天。每次观察后给试验鸡打分,正常鸡记作0,病鸡记作1,瘫痪鸡或出现其它神经症状记作2,死亡鸡记3(每只死亡鸡在其死后的每日观察中仍记3)。
IVPI值=每只鸡在10天内所有数字之和/(10只鸡×10天),如指数为3.00,说明所有鸡24小时内死亡;指数为0.00,说明10天观察期内没有鸡表现临床症状。
IVPI达到2.0或2.0以上者可判为新城疫中强毒感染。

 

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