⑴ 流感病毒RNA 提取：
用 Qiagen RNA 提取试剂盒 ，参照使用说明步骤如下：
1. 吸取560ul 含有载体RNA ( carrier RNA ) 的 Buffer AVL 到 一个干净的1.5ml Eppendorf 管。
2. 吸取140 ul病毒尿囊液/或含有病毒的样品液到上述的Eppendorf 管里，间断混匀15 秒，在室温下静置10分钟后快速离心。
3. 在上述的Eppendorf 管里加入560ul 无水乙醇，间断混匀15 秒后快速离心。
4. 从上述Eppendorf 管里吸取630 ul 混合液到一个干净的QIAamp 离心柱，10000 转离心一分钟。
5. 吸取剩余的630 ul 混合液到上述QIAamp 离心柱，10000 转离心一分钟。
6. 加750 ul Buffer AW1 至QIAamp 离心柱，10000 转离心一分钟。
7. 加750 ul Buffer AW2 至QIAamp 离心柱，10000 转离心一分钟。
8. 换一个干净的收集管，13000 转离心一分钟，把离心柱放入一个干净的1.5ml Eppendorf 管。
9. 在离心柱膜中央加入50 ul AVE ,室温下静置2-3 分钟后，10000 转离心一分钟。
⑵ cDNA合成：
① RNA 11.5 ul
Uni 12( 2 ug/ul) 0.5 ul
Total 12.0 ul
反应条件： 75.0°C 5min
4°C ∞
② 5 × First Strand Buffer 4.0 ul
DTT ( 0.1M) 2.0 ul
dNTP (10Mm) 1.0 ul
Reverse Transcriptase Ⅲ(200u/ul) 1.0 ul
Total 10.0 ul
反应条件： 55.0 °C 60 min
95.0 °C 5 min
4.0 °C ∞
⑶ PCR 扩增：
10× PCR Buffer 5.0 ul
Mgcl2 ( 25Mm) 3.0 ul
dNTP(10Mm) 1.0 ul
AmpliTaq Gold enzyme 0.5 ul
mQH20 34.5 ul
Forward Primer ( 10um) 2.5 ul
Reverse Primer (10um) 2.5 ul
cDNA 1.0 ul
Total 50.0 ul
反应条件： 1 Cycle 95.0°C 10 min
35 Cycle 94.0 °C 1min
55.0 °C 1min
72.0 °C 1.5min
1 Cycle 72.0 °C 10 min
4.0 °C ∞
(4) 电泳分析.
上一篇：昆虫病毒
下一篇：细胞免疫荧光法检测H5N1流感病毒抗体
