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微生物检验染色技术(2)



录入时间:2011-6-10 9:20:31 来源:检验地带网

三、制片和染色的基本程序
 
  微生物的染色方法很多,各种方法应用的染料也不尽相同,但是一般染色都要通过制片及一套染色操作程序。
 
1、制片
 
  在干净的载玻片上滴上一滴蒸馏水,用接种环进行无菌操作,挑取培养物少许,置载玻片的水滴中,与水混合做成悬液并涂成直径约1厘米的薄层,为避免因菌数过多聚成集团,不利观察个体形态,可在载玻片之一侧再加一滴水,从已涂布的菌液中再取一环于此水滴中进行稀释,涂布成薄层,若材料为液体培养物或固体培养物中洗下制备的菌液,则直接涂布于载玻片上即可。
 
2、自然干燥
 
  涂片最好在室温下使其自然干燥,有时为了使之干得更快些,可将标本面向上,手持载玻片一端的两侧,小心地在酒精灯上高处微微加热,使水分蒸发,但切勿紧靠火焰或加热时间过长,以防标本烤枯而变形。
 
3、固定
 
  标本干燥后即进行固定,固定的目的有三个:
 
  1)杀死微生物,固定细胞结构。
 
  2)保证菌体能更牢的粘附在载玻片上,防止标本被水冲洗掉。
 
  3)改变染料对细胞的通透性,因为死的原生质比活的原生质易于染色。
 
  固定常常利用高温,手执载玻片的一端(涂有标本的远端),标本向上,在酒精灯火焰外层尽快的来回通过3—4次,共约2—3秒钟,并不时以载玻片背面加热触及皮肤,不觉过烫为宜(不超过60℃),放置待冷后,进行染色。
 
  以上这种固定法在微生物实验室中虽然应用较多普遍,但是应当指出,在研究微生物细胞结构时不适用,应采用化学固定法。化学固定法最常用的固定剂有:酒精(95%),酒精和醚各半的混合物,丙酮,1—2%的饿酸等。饿酸能很快固定细胞但不改变其结构,故较常用。应用饿酸固定细胞的技术如下:在培养皿中放一玻璃,在玻璃上放置玻璃毛细管,在毛细管中注入少量的1—2%饿酸溶液,同时在玻璃上再放置湿标本涂片的载玻片,然后把培养皿盖上,经过1—2分钟后把标本从培养皿中取出,并使之干燥。
 
4、染色
 
  标本固定后,滴加染色液。染色的时间各不相同,视标本与染料的性质而定,有时染色时还要加热。染料作用标本的时间平均约1—3分钟,而所有的染色时间内,整个涂片(或有标本的部分)应该浸在染料之中。
 
  若作复合染色,在媒染处理时,媒染剂与染料形成不溶性化合物,可增加染料和细菌的亲和力。一般固定后媒染,但也可以结合固定或染色同时进行。
 
5、脱色
 
  用醇类或酸类处理染色的细胞,使之脱色。可检查染料与细胞结合的稳定程度,鉴别不同种类的细菌。常用的脱色剂是95%酒精和3%盐酸溶液。
 
6、复染
 
  脱色后再用一种染色剂进行染色,与不被脱色部位形成鲜明的对照,便于观察。革氏染色在酒精脱色后用番红,石碳酸复红最后进行染色,就是复染。
 
7、水洗
 
  染色到一定的时候,用细小的水流从标本的背面把多余的染料冲洗掉,被菌体吸附的染料则保留。
 
8、干燥
 
  着色标本洗净后,将标本晾干,或用吸水纸把多余的水吸去,然后晾干或微热烘干,用吸水纸时,切勿使载玻片翻转,以免将菌体擦掉。
 
9、镜检
 
  干燥后的标本可用显微镜观察。
 
  综上所述,染色的基本程序如下:
 
  制片→固定→媒染→染色→脱色→复染→水洗→干燥→镜检。

 

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