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细胞培养基的基本常识(下)



录入时间:2011-5-11 10:03:25 来源:互联网

抗生素
在细胞培养中最常用的抗生素是青霉素(常用浓度是25~100ui/ml)与链霉素(25~100μg/ml)。这两种抗生素常混合使用。在一些实验室里,它们常规加入所有的培养基中。庆大霉素(10~100μg/ml)通常有广谱抗菌效应,并具有溶液稳定性,故也被一些实验室使用,特别是当有低水平的污染存在时更是这样。以上这些试剂对霉菌与酵母菌的污染均无效。
尽管很多实验室在细胞系的培养基中常规加入抗生素作继代培养,但仍建议不要在原代培养中加入抗生素,其理由之一是获得的细胞是无菌的,原代培养时的细菌污染很少发生。其次,尽管认为抗生素对细胞代谢的影响可忽略,但最好避免使用它们,以免细胞生长环境的不稳定。最重要的是要意识到培养中主要污染物的类型,它们通常暗示了问题的来源。
 
抗有丝分裂剂
某些DNA合成抑制剂对分裂细胞有毒,但对没有DNA合成的细胞仅有轻微影响。由于神经元通常缺乏DNA合成能力,因此对抗有丝分裂剂没有多大反应。这样的试剂常常用于神经元的培养,以消除或减少非神经元群体。若要杀死所有的非神经元细胞,可以先加入血清或生长因子来保证有高比例的非神经元细胞进行DNA合成,此时再加入抗有丝分裂剂。但是,某些细胞在它的细胞周期的某些时相时对抗有丝分裂剂是不敏感的。不过,可以重复的将抗有丝分裂剂使用于增殖的细胞群体。在CNS神经元的培养中抗有丝分裂剂常常在星形细胞形成单层后加入,此时,星形细胞由于接触抑制而终止了DNA的合成(即细胞停止增殖),它们不会因抗有丝分裂剂的加入而死亡。原代培养中用这种方法阻止成纤维细胞的过度增殖是十分必要的。有两种抗有丝分裂剂常用于神经元的培养:Fluorodexyuridine,是胸苷合成酶抑制剂,一般使用浓度为~10μM。尿苷(10μM)也常使用,可阻止不分裂细胞的RNA合成。另外,阿糖胞苷也常被使用,其使用浓度为5~50μM。使用任何一种抗有丝分裂剂,都必须考虑它的神经原毒性,应该确定最低效应的使用浓度。阿糖胞苷在很低的浓度下,也会对某些种类的神经元有毒性,可以造成特定神经原的死亡。其他的抗有丝分裂剂尚未表现出这种毒性。
 
培养的保持
培养物是应该保持在孵箱中的。孵箱可以自动将O2与CO2混合很快达到培养基的设计要求,空气中的氧浓度比血液和脑脊液中要高得多。对于某些细胞的生长,包括神经原,应使氧含量处在一个较低的水平。可以用孵箱达到这个标准,但这样的孵箱并未广泛使用。
高湿度可避免培养皿中培养基的蒸发,保持孵箱中的湿度通常是在箱底部放上一大盆水,这水应该经常换,乘水容器应经常消毒以防霉菌生长。若孵箱曾被霉菌孢子严重污染过,那么要想完全去除污染则会非常困难。当培养物必须要长期保持在孵箱中时,应采用较少培养基的瓶、皿,且将盖子盖紧以避免蒸发,或采用相应的按比例供空气的孵箱。
 
温度的精确调节应定期检查,孵箱温度常设置为37℃或较低温度。细胞在低温时可有较长时间的忍耐限度,但当温度升至39℃时,几小时内即死亡。
 
维持培养物的最佳方案常常改变。例如培养胶质细胞时,要经常换液以使其增殖达到最大。而在培养某些神经原时,则要求尽可能少的换液,神经原在两次换液之间的条件下长的最好。大脑皮质的培养要求在不换液的情形下维持一个月以上。另一方面,象海马神经原那样的细胞,倚赖于条件培养基,若换液太频繁细胞就会衰退,此时,可采用1/3或1/2换液的方式。

 

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