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单核细胞增生李斯特菌及其检验



录入时间:2011-5-3 9:13:49 来源:食品伙伴网

单核细胞增生李斯特菌及其检验
 Listeria monocytogenes
一、概述
单核细胞增生李斯特菌 (L. monocytogenes)归属于李斯特菌属(Listeria)。单核细胞增生李斯特菌是李斯特菌属中唯一对人致病的病菌。
    李斯特菌是一种细胞内寄生菌,它不仅可能存在于肉类产品中,也可能存在于乳制品、蔬菜、沙拉及海产品等日常食物里面。此菌广泛分布于自然界中,在土壤、排污下水、地表水、青贮饲料、烂菜中均可分离到。人也可作为无症状携带者。据报道,健康人粪便中该菌的携带率为0.6%~16%,4%~8%的水产品、5%~10%的奶及其制品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被该菌污染。李斯特菌能在1~45℃的温度下生存,能在家用电冰箱的冷藏室内较长时间生长、繁殖。
    人感染的主要来源是食用被该菌污染的食品,主要通过粪-口途径传播。自然感染的传播途径包括消化道、呼吸道、眼结膜以及皮肤损伤。本菌主要引起致死性的脑膜炎和脓毒症,孕妇流产和新生儿细菌性脑炎。此菌的致病力强,尤其是免疫缺陷病人感染后,病死率可高达30%~70%。近几年来,李斯特菌病已呈世界性分布,北美和西欧等许多国家人食源性李斯特菌病日渐增多,且引起多起病人的死亡。因此,食品中存在的单核细胞增生性李斯特氏菌对人类的安全具有危险,如今已有20多个国家把它列为“食品致病菌”。
二、生物学特性
(一)形态与染色特性
该菌为革兰氏阳性短杆菌,有的菌体略弯曲,两端钝圆,大小约为0.4~0.5µm ´ 0.5~2.0µm。多单在,有时是V字型排列。  无芽孢,不产生荚膜。在陈旧培养物中或粗糙型菌落的菌体长度可达6~20µm或更长的丝状。在20~25℃培养时可产生2~4根鞭毛而运动,但在37℃培养时鞭毛发育不良,无运动性。
(二)培养特性
本菌需氧或兼性厌氧,生长温度为1~45℃,最适温度为30~37℃。对营养要求不高,可在普通琼脂培养基中生长,但在血琼脂培养基或胰酪胴琼脂上生长更好。加入0.2%~1%(W/V)的葡萄糖及2%~3%(V/V)的甘油生长更佳。在含1%(W/V)NaCl的复合培养基中能生长。在4℃可缓慢增殖,形成菌落约需7d。
在液体培养基中培养18~24h后,肉汤呈轻度均匀混浊,数天后形成粘稠沉淀附着于管底,摇动时沉淀呈螺旋状,继续培养可形成颗粒状沉淀。不形成菌环、菌膜。
在营养琼脂上,光滑(S)型可形成直径0.5~1.5mm、圆形、露滴状半透明、低隆起、边缘整齐、表面有细致纹理的蓝灰色菌落,斜射光照射时,菌落呈特征性蓝绿光泽。R型菌落表面起伏不平,边缘不整齐,细菌难以乳化。
在血液琼脂培养基上,可形成狭窄的β-溶血环,常不超出菌落边缘,移去菌落才可见。弱溶血或疑似溶血菌株可用协同溶血试验(CAMP)鉴定。
半固体培养基:沿穿刺线呈云雾状,随后缓慢扩散,在培养基表面下3~5mm处呈伞状。
(三)生化特性
该菌接触酶阳性,氧化酶阴性。能发酵多种糖类,产酸不产气,如发酵葡萄糖、果糖、海藻糖、乳糖、鼠李糖、麦芽糖、山梨糖,不发酵木糖、阿拉伯糖、棉子糖、蔗糖、甘露醇、蜜二糖、菊糖、纤维二糖和侧金盏花醇。不利用枸橼酸盐。不还原硝酸盐,不产生靛基质和硫化氢。甲基红及VP试验呈阳性。不液化明胶和凝固血清。可水解七叶苷和马尿酸钠。
(四)抵抗力
该菌对理化因素抵抗力较强,在土壤、粪便、青贮饲料和干草内能长期存活。对碱和盐的抵抗力强。常规的巴氏消毒法不能杀灭它,60~70℃经30 min才能杀死此菌。该菌体外试验对青毒素、氨苄青霉素、四环素均敏感,对土霉素敏感性差,对磺胺、枯草杆菌素和多粘菌素有抵抗力。
Listeria monocytogenes is a Gram-positive rod-shaped bacterium. It is the agent of listeriosesis, a serious infection caused by eating food contaminated with the bacteria.
The disease affects primarily pregnant women, newborns, and adults with weakened immune systems.
Listeriosesis is a serious disease for humans; the overt form of the disease has a mortality greater than 25 percent. The two main clinical manifestations are sepsis and meningitis. Meningitis is often complicated by encephalitis, a pathology that is unusual for bacterial infections.
This normal inhabitant of the gastrointestinal tract and of animal feces led to a 1986 outbreak in Massachusetts hospital patients.
Oxoid Limited has launched a new chromogenic medium for the improved isolation, enumeration and identification of Listeria from food samples.  In addition to providing presumptive identification of Listeria species, Oxoid Chromogenic Listeria Agar ( OCLA ) Plate (PO5165A) is also able to differentiate pathogenic Listeria monocytogenes and Listeria ivanovii from other Listeria species.
 
三、检验
常规细菌学检验   检验规程见GB/T 4789.30-2003
1. 涂片镜检    用生理盐水制成菌悬液,在油镜或相差显微镜下观察,该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。
2. 增菌培养    EB增菌液30±1℃培养48h~7d。LB1增菌液培养24h,取出0.1mL,加入10mL LB2增菌液中二次增菌。
3. 分离培养    将EB增菌液和LB2二次增菌液划线于选择培养基琼脂平板上,30±1℃48h,挑选可疑菌落,用白炽灯斜光照射平板,李斯特氏菌的菌落为灰蓝或蓝色、小的圆形菌落。
选5个以上的上述可疑菌落接种三糖铁(TSI)琼脂和EIM动力培养基,培养于25±1℃,观察是否有动力,及成伞状或月芽状生长。一般观察2~7d,阳性者可做下一步鉴定。将上述有动力、形成伞状者并在三糖铁琼脂培养基上层、下层产酸而不产硫化氢的可疑培养物接种于胰酪胨大豆琼脂培养基(TSA-YE)上,做纯培养供做以下鉴定。
4. 细菌鉴定
(1)对小鼠的致病力试验:取0.5mL浓缩菌液注射小白鼠腹腔,接种3~5只,观察小鼠死亡情况。致病株2~5d 内死亡。单核细胞增生李斯特氏菌对小鼠有致病性,在肝和脾可见到局部坏死,并能从脏器和心血中分离出细菌。
(2)协同溶血试验(CAMP):在血平板上平行接种金黄色葡萄球菌和马红球菌(R.equi),在它们中间垂直接种可疑李斯特氏菌,但不要触及,30℃培养24~48h,检查平板中垂直接种点对溶血环的影响。靠近金黄色葡萄球菌接种点的单核细胞增生李斯特菌的溶血增强,西尔李斯特氏菌的溶血也增强,而绵羊李斯特氏菌在马红球菌附近的溶血增强,有助于鉴别。
5. 结果报告    根据病料涂片镜检结果可作出初步判断;依据细菌分离培养和细菌鉴定的各项试验结果,可作出从检样中检出单核细胞增生李斯特菌的报告。

 

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