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微生物常规鉴定技术



录入时间:2011-4-27 10:32:31 来源:食品伙伴网

微生物常规鉴定技术
一、形态结构和培养特性观察
1、微生物的形态结构观察
微生物的形态结构观察主要是通过染色,在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构(包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等)及染色特性进行观察,直观地了解细菌在形态结构上特性,根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。
2、微生物培养特性观察
革兰染色法,丹麦病理学家C.Gram 1884年创立(1)涂片 (2)晾干 (3)固定 (4)结晶紫色染色:1min。水洗 (5)媒染:滴加卢哥氏碘液,媒染1min。水洗(6) 脱色:将玻片倾斜,连续滴加95%乙醇脱色20~25s至流出液无色,立即水洗。 (7) 复染:滴加蕃红复染5min。水洗(8) 晾干:晾干或者用吸水纸吸干。 (9) 镜检:先用低倍,再用高倍,最后用油镜。 (10)实验完毕后的处理:①浸过油的镜头:a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2~3次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2~3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。②细菌染色玻片用废擦镜纸将香柏油擦干。
微生物培养特性的观察是微生物检验鉴别中的一项重要内容。
1)细菌的培养特征    包括以下内容:在固体培养基上,观察菌落大小、形态、颜色(色素是水溶性还是脂溶性)、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况(菌膜、环)混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。
2)霉菌酵母菌的培养特征:大多数酵母菌没有丝状体,在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似,只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似,有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。
霉菌有分支的丝状体,菌丝粗长,在条件适宜的培养基里,菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色,因而菌落边缘和中心,正面和背面颜色常常不同,如青霉菌:孢子青绿色,气生菌丝无色,基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。
二、生理生化试验
微生物生化反应:指用化学反应来测定微生物的代谢产物,生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。
微生物检验中常用的生化反应有:
糖或醇类发酵试验       淀粉水解试验       V-P试验       甲基红(MR)试验          靛基质(Indole)试验    
过氧化氢酶试验        硝酸盐还原试验     明胶液化试验   尿素酶(Urease)试验         氧化酶试验              
硫化氢(H2S)试验   三糖铁(TSI)琼脂试验    氨基酸脱羧酶的测定    耐盐性试验      卵磷脂酶的测定
石蕊牛奶反应           酪蛋白水解      苯丙氨酸脱氨试验       氰化钾试验            对叠氮化钠的抗性     
硫化氢-靛基质-动力(SIM)琼脂试验        含碳化合物的利用(柠檬酸盐或丙酸盐利用)
三、血清学试验
血清学反应是指:相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用,可出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。在食品微生物检验中,常用血清学反应来鉴定分离到的细菌,以最终确认检测结果。
在细菌的检测中,应用最多的是凝集试验、沉淀反应和补体结合试验。
血清学试验的一般特点:
1)抗原体的结合具有特异性,当有共同抗原体存在时,会出现交叉反应。
2)抗原体的结合是分子表面的结合,这种结合虽相当稳定,但是可逆的。
3)抗原体的结合是按一定比例进行的,只有比例适当时,才能出现可见反应。
4)血清学反应大体分为两个阶段进行,但其间无严格界限。第一阶段为抗原体特异性结合阶段,反应速度很快,只需几秒至几分钟反应即可完毕,但不出现肉眼可见现象。第二阶段为抗原体反应的可见阶段,表现为凝集、沉淀、补体结合反应等。反应速度慢,需几分、几十分以至更长时间。而且,在第二阶段反应中,电解质、PH、温度等环境因素的变化,都直接影响血清学反应的结果。
1、凝集反应(Agglutination reaction)
颗粒性抗原(细菌、红细胞等)与相应抗体结合,在电解质参与下所形成的肉眼可见的凝集现象,称为凝集反应。其中的抗原称为凝集原,抗体称为凝集素。在该反应中,因为单位体积抗体量大,做定量实验时,应稀释抗体。
1)直接凝集反应:a. 玻片凝集法; b. 试管凝集法       2)间接凝集反应
2、沉淀反应(Precipitation test)
可溶性抗原与相应抗体结合,在有适量电解质存在下,经过一定时间,形成肉眼可见的沉淀物,称为沉淀反应。反应中的抗原称为沉淀原,抗体为沉淀素。由于在单位体积内抗原量大,为了不使抗原过剩,故应稀释抗原,并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。
1)环状沉淀反应 2)絮状沉淀反应3)琼脂扩散试验
3、补体结合反应(Complement fixation reaction)
补体结合反应是在补体参与下,以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统的抗原抗体反应。补体无特异性,能与任何一组抗原抗体复合物结合而引起反应。如果补体与绵羊红细胞、溶血素的复合物结合,就会出现溶血现象; 如果与细菌及相应抗体复合物结合,就会出现溶菌现象。因此,如果出现溶菌,说明抗原抗体是相对应的(试验结果阳性);如果出现溶血,说明抗原抗体不相对应(阴性)。
此反应操作复杂,敏感性高,特异性强,能测出少量抗原和抗体,所以应用范围较广。
其它方法:荧光抗体技术,   ELISA,   免疫组化
 
 
•        http://www.foodmate.net/lesson
•        周阳生(2001). 动物性食品微生物学检验.中国农业出版社
•        王自振主编(1991). 食品微生物检验学. 中国科学技术出版社
•        吴润主编(1997). 食品卫生微生物学检验. 甘肃科学技术出版社
•        王亚宾主编(2003). 动物性食品检验学. 中国科学技术出版社
•        刘用成(2006).食品检验技术-(微生物部分)(适合食品检验与质量控制技术专业)中国轻工业出版社
 

 

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