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药敏试验操作



录入时间:2011-4-21 13:46:47 来源:中华检验医学网

实验步骤
一、实验材料
 
  普通营养琼脂培养基:可去生化试剂店购买,做不同细菌的药敏试验可选择不同的培养基,如做大肠杆菌的药敏试验可选择普通营养琼脂或麦康凯培养基。做沙门氏菌可选择血清培养基。
  药敏试纸:购买或自制(详见实验准备)
  细菌:待做药敏试验的细菌
  仪器:接种环、酒精灯、打孔器、牛津杯、移液器、滴头
 
二、实验准备
 
  2.1 药敏片的准备:购买或自制
  2.1.1 制备方法:取新华1号定性滤纸,用打孔机打成6毫米直径的圆形小纸片。取圆纸片50片放入清洁干燥的青霉素空瓶中,瓶口以单层牛皮纸包扎。经15磅15-20分钟高压消毒后,放在37℃温箱或烘箱中数天,使完全干燥。
  2.1.2 抗菌药纸片制作:在上述含有50片纸片的青霉素瓶内加入药液0.25毫升,并翻动纸片,使各纸片充分浸透药液,翻动纸片时不能将纸片捣烂。同时在瓶口上记录药物名称,放37℃温箱内过夜,干燥后即密盖,如有条件可真空干燥。切勿受潮,置阴暗干燥处存放,有效期3-6个月。
  2.2 药液的制备(用于商品药的试验):按商品药的使用治疗量的比例配制药液;如商品药百病消按其说明量治疗量0.01%饮水,可按这个比例配制药液,可取10毫克加入10毫升的水中混匀。此稀释液即为用于做药敏试验的药液。
 
三、实验操作方法
 
  3.1 药敏片法
  3.1.1 在“超净台”中,用经(酒精灯)火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物,以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式;用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌,以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后,找到第二点划线至平皿的1/2,依次划线,直至细菌均匀密布于平皿。(另:可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液,用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密)
  3.1.2 将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停,取药敏片贴到平皿培养基表面。为了使药敏片与培养基紧密相贴,可用镊子轻按几下药敏片。为了使能准确的观察结果,要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上;一般可在平皿中央贴一片,外周可等距离贴若干片(外周一般可贴七片),每种药敏片的名称要记住。
  3.1.3 将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后,观察效果。
  3.2 牛津杯法
    3.2.1 在“超净台”中,用经(酒精灯)火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物,以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式;用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌,以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后,找到第二点划线至平皿的1/2,依次划线,直至细菌均匀密布于平皿。(另:可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液,用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密。)
  3.2.2 以无菌操作将灭菌的不锈钢小管(内径6nm、外径8nm、高10nm的圆形小管,管的两端要光滑,也可用玻璃管、瓷管),放置在培养基上,轻轻加压,使其与培养基接触无空隙,并在小管处标记各种药物名称。每个平板可放4-6支小管。待分钟后,分别向各小管中滴加一定数量的各种药液,勿使其外溢。置37℃培养8-18小时,观察结果。
  3.2.3 将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后,观察效果。
  3.3 打孔法:
  该法较简单,成本低,易操作,比较适用于商品药物的检测。
  3.3.1 在“超净台”中,用经(酒精灯)火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物,以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式;用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌,以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后,找到第二点划线至平皿的1/2,依次划线,直至细菌均匀密布于平皿。(另:可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液,用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密。)
  3.3.2 以无菌操作将灭菌的不锈钢小管(外径为4毫米、孔径与孔距均为3毫米,管的两端要光滑,也可用玻璃管、瓷管),放置在培养基上打孔,将孔中的培养基用针头挑出,并以火焰封底,使培养基能充分的与平皿融合(以防药液渗漏,影响结果)。
  3.3.3 加样:按不同药液加样,样品加至满而不溢为止。
  3.3.4 将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后,观察效果。
 
结果观察
 
  在涂有细菌的琼脂平板上,抗菌药物在琼脂内向四周扩散,其浓度呈梯度递减,因此在纸片周围一定距离内的细菌生长受到抑制。过夜培养后形成一个抑菌圈,抑菌圈越大,说明该菌对此药敏感性越大,反之越小,若无抑菌圈,则说明该菌对此药具有耐药性。其直径大小与药物浓度、划线细菌浓度有直接关系。
 
判定标准
 
  一、药敏实验的结果,应按抑菌圈直径大小作为判定敏感度高低的标准。
  表1 药物敏感实验判定标准
抑菌圈直径(毫米) 敏感度
20以上 极敏
15~20 高敏
10~14 中敏
10以下 低敏
0 不敏
 
  二、药物敏感实验判定标准参考表1,多黏菌素抑菌圈;在9毫米以上为高敏,6—9毫米为低敏,无抑菌圈为不敏。
 

 

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