1 目的

1.1 了解微生物分离和纯化的原理

1.2 掌握常用的分离纯化微生物的方法

2 原理

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。

土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。本实验将采用不同的培养基从土壤中分离不同类型的微生物。

3 材料

3.1  培养基  

淀粉琼脂培养基(高氏I号培养基)，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，查氏琼脂培养基。

3.2  溶液或试剂  

10%酚液，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4%水琼脂。

3.3  仪器或其它用具

无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，链霉素和土样，显微镜，血细胞计数板、涂布器等。

4 流程

倒平板→制备梯度稀释液→涂布（或划线法）→培养→挑单菌落→保存。

5 步骤

5.1  稀释涂布平板法

5.1.1  倒平板

将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏I号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基加热溶化待冷至55～60℃时，高氏I号琼脂培养基中加入10%酚数滴，马丁氏培养中加入链霉素溶液(终浓度为30μg/ml)，混合均匀后分别倒平板，每种培养基倒三皿。

倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒人培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。

5.1.2  制备土壤稀释液

称取土样l0g，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min，使土样与水充分混合，将细胞分散。用一支lml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取lml(无菌操作见图-2)加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的土壤溶液，注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换一支试管。 

5.1.3  涂布

将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10^-4、10^-5和10^-6三种稀度，然后用无菌吸管分别由10^-4、10^-5和10^-6 三管土壤稀释液中各吸取0.1或0.2ml，小心地滴在对应平板培养基表面中央位置用无菌玻璃涂棒按图4-2所示，右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。室温下静置5～l0min，使菌液浸入培养基。

5.1.4  培养

将高氏I号培养基平板和马丁氏培养基平板倒置于28℃温室中培养3～5d，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃温室中培养2～3d。

5.1.5  挑菌落     

将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到上述三种培养基斜面上(图4-1 C)，分别置28℃和37℃温室培养。若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。

5.2  平板划线分离法

5.2.1  倒平板

按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、土样编号和实验日期。

5.2.2  划线

在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述10-l的土壤悬液一环在平板上划线(图4-3)。划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。常用的划线方法有下列二种：用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3～4条，再转动培养皿约70度角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作第三次划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线(图4-4)。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。

5.2.3  挑菌落 

同稀释涂布平板法，一直到分离的微生物认为纯化为止。

5.2.5  结果判定

所做涂布平板法和划线法是否较好地得到了单菌落？如果不是，请分析其原因并重做。