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实验——沙门氏菌属(Salmonella)的检验



录入时间:2011-4-12 13:22:33 来源:天津农学院精品课程

1 目的
1.1 理解沙门氏菌属生化反应及其原理
1.2 掌握沙门氏菌属血清因子使用方法
1.3 掌握沙门氏菌属的系统检验方法
2 原理
沙门菌属是一大群寄生于人类和动物肠道,其生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌。种类繁多,少数只对人致病。其他对动物致病,偶尔可传染给人。主要引起人类伤寒,副伤寒以及食物中毒或败血症。在世界各地的食物中毒中,沙门氏菌食物中毒常占首位或第二位。
食品中沙门氏菌的检验方法有五个基本步骤:1 前增菌;2 选择性增菌;3 选择性平板分离沙门氏菌;4 生化试验,鉴定到属;5 血清学分型鉴定。目前检验食品中的沙门氏菌是按统计学取样方案为基础,25g食品为标准分析单位。本实验以蛋品为检测样品,以已知的沙门氏菌和大肠埃希氏菌为对照。
3 材料
3.1 菌种
沙门氏菌(Salmonella sp.)
大肠埃希氏菌(E.col.)
3.2 检样
冻肉、蛋品、乳品等。
3.3 培养基
缓冲蛋白胨水(BP)、氯化镁孔雀绿(MM)增菌液、四硫酸钠煌绿(TTB)增菌液、亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液、SS琼脂、EMB琼脂、亚硫酸铋琼脂(BS)、三糖铁琼脂(TSI)、蛋白胨水、尿素培养基、赖氨酸脱羧酶试验培养基、鸟氨酸脱羧酶试验培养基、丙二酸钠培养基、氰化钾(KCN)培养基、ONPG培养基、缓冲葡萄糖蛋白胨水、DHL琼脂、HE琼脂。
3.4 试剂
吲哚试剂、V-P试剂、甲基红试剂、氧化酶试剂,沙门菌A—F多价诊断血清,革兰氏染色液等。
3.5 器具
天平(称取检样用)、均质器或乳钵、显微镜、广口瓶、三角烧瓶、吸管、平皿、金属匙或玻璃棒、接种棒、试管架。
4 流程
 
5 步骤
5.1 前增菌和增菌 
沙门氏菌在食品加工过程中,常常受到损伤而处于濒死状态,因此经过加工的食品检验沙门氏菌时应进行前增菌,即用不加任何抑菌剂的培养基缓冲蛋白胨水(BP),进行增菌,使濒死状态的沙门氏菌恢复活力。一般增菌时间为4h,增菌时间不宜过长,由于BP培养基中没有抑菌剂,时间太长了,杂菌也会相应增多。干蛋品特殊,蛋品中的主要病原菌为沙门氏菌,其在加工过程中受到的损伤又较严重,因此应适当延长前增菌时间,一般为18~24h。
无菌操作称冻蛋取25g样品,加入盛有225mL灭菌缓冲蛋白胨水的500mL广口瓶内(瓶内预放玻璃珠若干粒),塞紧瓶口,充分摇匀。在36±1℃培养4h(干蛋品需培养13~24h),移10ml氯化镁孔雀绿增菌液或四硫酸钠煌绿增菌液,在42℃培养18~24h。同时另取10ml,加入100ml亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液内,在36±1℃培养18~24h。
鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。各取25g(25ml)加入灭菌生理盐水25mL,按前法做成检样匀液,取半量,接种于100mLMM(或TTB)增菌液内,于42 oC培养24h;另半量接种于100mLSC增菌液内,于36±1 oC培养18~24h。
5.2 分离
取增菌液和混合液各1环,分别划线接种于一个BS平板和一个DHL琼脂平板(或HE琼脂平板、WS或SS琼脂平板)。于36±1 oC培养18~24h(DHL、HE、WS、SS)或40~48h(BS),观察各个平板上生长的菌落。先观察混合菌种平板,再检查样品平板上有无可疑菌落,挑取菌种平板和样品平板上的可疑菌落进行革兰氏染色与镜检。
5.3 三糖铁高层琼脂初步鉴别
将上述革兰氏阴性杆菌的可疑菌落,挑取数个接种一支三糖铁高层琼脂斜面,于36±1 oC培养18~24h,并根据表4-1初步判断是否可疑沙门氏菌。
5.4 生化试验
在接种三糖铁琼脂的同时,接种蛋白胨水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基及对照培养基各1管,于36±1 oC培养18~24h,必要时可延长至48h,按表4-2判定结果。按反应序号分类,沙门氏菌属的结果应属于A1、A2和B1,其它5种反应结果均可以排除。
表4-2  肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表
5.4.1 反应序号A1 
典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸3项中有1项异常,按表4-3可判定为沙门氏菌。如有2项异常,则按A3判定为弗劳地氏柠檬酸杆菌。
表4-3  沙门氏菌属生化鉴别表
5.4.2 反应序号A2     
可先作血清学鉴定,如A~F多价O血清不凝聚时,补做甘露醇和山梨醇试验,按表4-4判定结果。
表4-4
5.4.3 反应序号B1 
三糖高层斜面产酸的菌株可予以排除,不产酸的应该先作血清学鉴定。如A~F多价O血清不凝聚时,补做鸟氨酸、ONPG,水杨苷、棉子糖和半动力试验。按表4-5 判断结果。必要时按表4-6进行沙门氏菌生化群的鉴别
表4-5  沙门氏菌属各生化群的鉴别
表4-6  沙门氏菌属各生化群的鉴别
5.5 血清学分型鉴定
5.5.1  抗原的准备
一般采用1.5%琼脂斜面培养物作为玻片凝集试验用的抗原。O血清不凝集时,将菌株接种在琼脂量较高的(如 2.5%~3%)培养基上检查,O抗原在干燥环境中发育较好;如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时,可挑取菌苔于1mL生理盐水中做成浓菌液,于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H抗原发育不良时,将菌株接种在0.7%~0.8%半固体琼脂平板的中央,待菌落蔓延生长时,在其边缘部分取菌检查;或将菌株通过装有0.3~0.4%半固体琼脂的小玻管1~2次,自远端取菌培养后再检查。
5.5.2  O抗原的鉴定
用A~F多价O血清做玻片凝集试验,同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株,不能分型。
被A~F多价O血清凝集者,一次用O4、O3.10、O7、O8、O9、O2和O11因子血清做凝集试验。根据试验结果,判定O群。被O3.10血清凝集的菌株,再用O10、O15、O34、O19单因子血清做凝集试验,判定E1、E2、E3、E4各亚群,每一个O抗原成分的最后确定均应根据O单因子血清的检查结果,没有O单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。
不被A~F多价O血清凝集者,先用57种或163种沙门氏菌因子血清中的9种多价O血清检查,如有其中一种血清凝集,则用这种血清所包括的O群血清逐一检查,以确定O群。每种多价O血清所包括的O因子如下:
O多价1  A,B,C,D,E,F群(并包括6,14群)
O多价2  13,16,17,18,21群
O多价3  28,30,35,38,39群
O多价4  40,41,42,43群
O多价5  44,45,47,48群
O多价6  50,51,52,53群
O多价7  55,56,57,58群
O多价8  59,60,61,62群
O多价9  63,65,66,67群
5.5.3  H抗原的鉴定
属于A~F各O群的常见菌型,依次用表7所述H因子血清检查第1相和第2相的H抗原。
表4-7   A~F群常见菌型H抗原表
不常见的菌型,先用163种沙门氏菌因子血清中的8种多价H血清检查,如有其中一种或两种血清凝集,则再用这一种或两种血清所包括的各种H因子血清逐一检查,以确定第1相和第2相的H抗原。8种多价H血清所包括的H因子如下:
H多价1  a,b,c,d,i
H多价2  eh,enx,enz15,fg,gms,gpu,gq,mt,gz51
H多价3  k,r,y,z,z10,lv,lw,lz13,lz28,lz40
H多价4  1,2;1,5;1,6;1,7;z6
H多价5  z4z23,z4z24,z4z32,z29,z35,z36,z38
H多价6  z39,z41,z42,z44
H多价7  z52,z53,z54,z55
H多价8  z56,z57,z60,z61,z62
每一个H抗原成分的最后确定均应根据H单因子血清的检查结果,没有H单因子血清的要用两个H复合因子血清进行核对。
检出第1相H抗原而未检出第2相H抗原的或检出第2相H抗原而未检出第1相H抗原的,可在琼脂斜面上移种1~2代后再检查。如仍只检出一个相的H抗原,要用位相变异的方法检查其另一个相。单相菌不必作位相变异检查。
5.5.4  Vi抗原的鉴定
用Vi因子血清检查。已知具有Vi抗原的菌型有:伤寒沙门氏菌,丙型副伤寒沙门氏菌,都柏林伤寒沙门氏菌。
6 结果
综合以上生化试验和血清学分型鉴定的结果,按照表或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型,并报告结果。
7 思考题
7.1 如何提高沙门氏菌得检出率?
7.2 沙门氏在三糖铁培养基上的反应结果如何?为什么?
7.3 沙门氏菌检验有哪五个基本步骤?
7.4 食品中能否允许有个别沙门氏菌存在?为什么?
 

 

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