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实验——志贺氏菌属(Shigella)检验



录入时间:2011-4-12 13:21:35 来源:天津农学院精品课程

1 目的
1.1 了解志贺氏菌属系统检验原理
1.2 理解志贺氏菌属生化反应原理
1.3 掌握志贺氏菌属系统检验方法
2 原理
志贺氏菌属的细菌,又称为痢疾杆菌。能引起痢疾症状的病原微生物很多,如志贺氏茵属、沙门氏茵属、变形杆菌属、埃希氏菌属等,还有阿米巴原虫、鞭毛虫及病毒等,其中以志贺氏菌引起的细菌性痢疾最为常见。人类对志贺氏菌的易感性较高,所以在食物和饮用水的卫生检验时,常以是否含有志贺氏茵作为指标。
与肠杆菌科各属细菌相比较,志贺氏菌属的主要鉴别特征为不运动,对各种糖的利用能力较差,并且在含糖的培养基内一般不形成可见气体。除运动力与生化反应外,志贺氏菌的进一步分群分型有赖于血清学试验。
3 材料
3.1 菌种
某种志贺氏菌(Shigella sp.
大肠埃希氏菌(E. coli
3.2 检样
食品检样
3.2 培养基及试剂
CN增菌液、HE琼脂、SS琼脂、伊红美蓝琼脂(EMB)、麦康凯琼脂、三糖铁琼脂(TSI)、半固体肉汤蛋白胨试管、赖氨酸脱羧酶试验培养基、苯丙氨酸培养基、西蒙氏柠檬酸琼脂、葡萄糖铵琼脂、葡萄糖半固体、缓冲葡萄糖蛋白陈水、糖发酵管(棉籽糖,甘露糖,甘油,七叶苷及水杨苷)、5%乳糖发酵管、蛋白胨水、尿素琼脂。
氰化钾(KCN)、吲哚试剂、加基红试剂,V-P试剂、氧化酶试剂、志贺氏菌属诊断血清。
3.4 器具
天平(称取检样用)、均质器和乳钵、温箱、显微镜、灭菌光口瓶、灭菌三角瓶、灭菌平皿、载玻片、酒精灯、灭菌金属匙或玻璃棒、接种棒、镍铬丝、试管架、试管篓、硝酸纤维素滤膜。
4 流程
 
5 步骤
5.1 增菌
称取检样25g,加入装有225mLGN增菌液的500mL广口瓶内,固体食用均质器以8 000~10 000r/m打碎1min,或用乳钵加灭菌砂磨碎,粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化,于36℃培养6~8h,培养时间视细菌生长情况而定,当培养液出现轻微混浊时即应终止培养。
5.2 分离
取增菌液1环,划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板1个;另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板或伊红美蓝琼脂平板1个,于36℃培养18~24h,志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。
5.3 生物化学试验
   挑取乎板上的可疑菌落,接种在三糖铁琼脂和半固体各一管。一般应多挑几个茵落
以防遗漏。志贺氏茵属在三糖铁琼脂内的反应结果为底层产酸,不产气(福氏志贺氏茵
6型可微产气),斜面产碱,不产生硫化氢;半固体管内沿穿刺线生长,无动力,具有以
上特性的菌株,疑为志贺氏菌,可做血清学凝集试验。
    在做血清学试验的同时,应同时做苯丙氨酸脱氨酶、赖氨酸脱羧酶、西蒙氏
柠檬酸盐和葡糖胺、尿素、KCN、水杨苷、七叶苷试验,志贺氏茵属均为阴性反应。必要时应做革兰氏染色检查和氧化酶试验,应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。并用生化试验方法做4个生化群的鉴定。见表5-1
表5-1 志贺氏菌属四个群的生化特性
生 化 群
5%乳糖
甘露醇
棉籽糖
甘油
靛青质
A群:痢疾志贺氏菌
-
-
-
(+)
-/+
B群:福氏志贺氏菌
-
+
+
-
(+)
C群:鲍氏志贺氏菌
-
+
-
(+)
-/+
D群:宋内氏志贺氏菌
(+)
+
+
d
-
注:+阳性;-阴性;-/+多数阴性,少数阳性;(+)迟缓阳性;d有不
5.4 血清学分型
挑取三糖铁琼脂上的培养物,做玻片凝集试验。先用4种志贺氏菌多价血清检查。如果由于K抗原的存在而不出现凝集,应将菌液煮沸后再检查;如果呈现凝集,则用A1、A2、B群多价和D群血清分别试验。如系B群福氏志贺氏菌,则用群和型因子血清分别检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见表5-2。可先用群因子血清检查,再根据群因子血清出现凝集的结果,依次选用型因子血清检查(表5-3)。
表5-2  福氏志贺氏菌各型和亚型的型抗原和群抗原
型和亚型
型抗原
群抗原
在群因子血清中的凝集
3,4
6
7,8
1a
I
1,2,4,5,9……
+
-
-
1b
I
1,2,4,5,9……
+
+
-
2a
II
1,3,4……
+
-
-
2b
II
1,7,8,9……
-
-
+
3a
III
1,6,7,8,9……
-
+
+
3b
III
1,3,4,6……
+
+
-
4a
IV
1,(3,4)……
(+)
-
-
4b
IV
1,3,4,6……
+
+
-
5a
V
1,3,4……
+
-
-
5b
V
1,5,7,9……
-
-
+
6
VI
1,2,(4)……
(+)
-
-
X变体
1,7,8,9……
-
-
+
Y变体
1,3,4……
+
-
-
注:+凝集;-不凝集;()有或无。
6 结果
根据实验过程详细记录样品和对照菌种的各项结果,并做出结论报告。
7 思考
7.1 如何检出食品中的志贺氏菌?
7.2 根据培养和生化试验,有否检出志贺氏菌?
7.3 根据生化特性和血清学试验,检出的志贺氏菌属哪个群?哪个型?

 

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