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SPA的提取



录入时间:2010-10-29 11:04:37 来源:生命经纬知识库

SPA提取的方法很多,包括煮沸法、溶菌酶法、葡萄球菌溶素法、超生波法以及三氯醋酸法等。现将常用的方法介绍如下:

1.煮沸提取法

     ⑴ 将菌株接种于蛋白胨葡萄糖琼脂培养基上,37培养20h~24h。
   0.15mol/L pH5.9PB液将菌苔洗下,配成10%V/V)的悬液。
   水浴中煮沸1h,迅速冷却至4,4000r/min离心20min,去沉淀。
   1mol/LHCl将上清液调pH3.0~3.5,然后4000r/min离心30min。
   沉淀以pH5.9PB溶解,然后12 000r/min离心20min。
   上清液加4.7倍量的95%酒精,充分混合后,4000r/min离心20min。
   沉淀(可直接冻干为粗提SPA制品)加PH7.4PBS液溶解,12000r/min离心20min。
   上清液即为粗提SPA液。
   Sephadex G100过柱,上样后用0.05mol/L pH7.4 PBS液洗脱,流速控制在每管2ml~3ml/20min,收集流出液。
   OD275nm值及用对流免疫电泳检测每管的活性,将有活性的各管合并、浓缩或冻干。

2.溶菌酶消化法

将培养的SPA菌以pH 8.0 0.02mol/L Tris-HCl缓冲液配成10%~15%的悬液。
   20:1W/W)的量加入SPA菌液与溶菌酶(活力为1U/mg蛋白)37水溶搅拌24h。
   4冷却后,以12000g离心30min。
   取上清,调pH值至7.0。
   加硫酸铵,边加边搅拌,使溶液呈80%的饱和度,4过夜。
   12000g离心30min。
   以少量蒸馏水将沉淀溶解。
   透析或过Sephadex G50除盐,即为粗制的SPA制品。

 

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