一．实验目的

加深对培养方法的认识，了解补料分批续培养过程控制方法。

二．实验原理

补料分批培养，是一种介于分批培养和连续培养之间的过渡培养方式，是在分批培养的过程中，间隙或连续地补加新鲜培养基的培养方法。流加培养同时兼有间歇培养和连续培养的某些特点，其优点是，可使发酵系统中维持很低的底物浓度，减少底物的抑制或其分解代谢物的阻遏作用，不会出现当某种培养基成分的浓度高时影响菌体得率和代谢产物生成速率的现象。

三．菌种与培养基

1.啤酒酵母

2．培养基(g/L)

葡萄糖20，酵母浸粉 5.0，KH₂PO₄ 3.0，Na₂HP0₄ 1.0，MgSO₄  1.0，pH 5.0。流加的浓葡萄糖液质量浓度为25 g／100 ml。保持培养基中糖的质量浓度在0.5 g/L，流加液的糖的质量浓度为25—30 g/100 m1。

四．实验方法

1．流加培养前的准备工作 

在培养罐中加入去离子水，将温度传感器、除菌过滤器安装好，用硅橡胶管连接好取样口、流加液入口，不需要的接口全部封好。橡胶管用弹簧夹夹住，排气口用一小段棉花塞好。确认所有连接没有问题后，打开通风排气系统，检查是否有漏气、阻塞现象(轻轻堵住排气口，看其他地方是否漏气)，确认正常。

2.种子培养

自斜面菌种挑起一环啤酒酵母菌体。接入装有50ml 培养基的250 ml三角瓶中，摇匀后，置于24℃培养箱培养36 h。将上述培养好的液体种子接入用250ml三角瓶装的灭过菌的100ml液体培养基中，接种量10％，在24℃下培养36h。

3．流加培养   

培养罐中加入已调配好的培养基后，放在灭菌锅中灭菌121℃，20－30 min，葡葡糖和消泡剂分别同时灭菌。培养罐取出后，开通冷却水进行冷却，同时开动搅拌器，通入无菌压缩空气以防产生负压,冷却到发酵温度25 ℃。利用硅皮管将25 g/100m1葡萄糖液贮瓶和0.1 mol/L氨液贮瓶分别连接蠕动泵和培养罐上的入口，再将两个贮瓶上的排气口塞上棉花用弹簧夹夹住。消泡剂贮瓶排气口塞上锦花。如果传感器不能用蒸汽加压灭菌，可以在室温下把传感锡在75％酒精中浸泡加进行灭菌，然后用无菌水洗净，尽快安装在培养罐上。通气量在3—5 L/min，搅拌转数在200～600rpm接种量10％。开动蠕动泵流加25g/100mL葡萄糖，使发酵罐内葡萄糖浓度达到20～30g/L，滴加0.1 mol/L氨液，控制培养掖pH为5.0。通过调节风量和搅拌转数控制溶氧浓度在10％左右。流加培养7—10h，每隔0.5-1h取样测定培养液中葡萄糖浓度、菌体量和副产物乙醇浓度。取样口经常用75％的酒精浸泡以保持清洁。培养结束后，将培养液进行蒸汽加压灭菌弃去。清洗培养罐。在发酵过程中消泡剂应尽量少加。

四．分析方法

1．菌体量(X) 生物量的测定

生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。本实验采用比浊法。以空白培养基为对照，在550 nm处测定发酵液的吸光值。

五．实验结果

（1）画出培养液中酵母菌体量(g/L)随流加培养时间的变化曲线。

（2）计算酵母细胞的产率(质量分数，葡萄糖)。

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