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水中细菌总数的测定和大肠菌群的检测(2)



录入时间:2010-9-25 11:22:11 来源:生物信息网

1)生活饮用水或食品生产用水的检验:
 
    ①初步发酵试验:
    在2个各装有50mL的3倍浓缩乳糖胆盐蛋白胨培养液(可称为三倍乳糖胆盐)的三角瓶中(内有倒置杜氏小管),以无菌操作各加水样100mL。在10支装有5mL的三倍乳糖胆盐的发酵试管中(内有倒置小管),以无菌操作各加入水样10mL。如果饮用水的大肠菌群数变异不大,也可以接种3份100mL水样。摇匀后,37℃培养24h。
    ②平板分离:
    经24h培养后,将产酸产气及只产酸的发酵管(瓶),分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板(EMB培养基)上,37℃培养18—24h。大肠菌群在EMB平板上,菌落呈紫黑色,具有或略带有或不带有金属光泽,或者呈淡紫红色,仅中心颜色较深;挑取符合上述特征的菌落进行涂片,革兰氏染色,镜检。
 ③复发酵试验:
 将革兰氏阴性无芽胞杆菌的菌落的剩余部分接于单倍乳糖发酵管中,为防止遗漏,每管可接种来自同一初发酵管的平板上同类型菌落1—3个,37℃培养24h,如果产酸又产气者,即证实有大肠菌群存在。
    ④报告:
    根据证实有大肠菌群存在的复发酵管的阳性管数,查表2(或表3),报告每升水样中的大肠菌群数(MPN)。
    2)水源水的检验:
    用于检验的水样量,应根据预计水源水的污染程度选用下列各量。
    ①严重污染水:1,0.1,0.01.0.00lmL各1份。
    ②中度污染水:10.1,0.1,0.01mL各1份。
    ③轻度污染水:100,10,1,0.1mL各l份。
④大肠菌群变异不大的水源水:10mLl0份。
表2 大肠菌群检索表(饮用水)

 
0
1
2
备注
每升水样中大肠菌群数
0
<3
4
11
接种水样总量300mL(100 mL2份,10 mL10份)
1
3
8
18
2
7
13
27
3
11
18
38
4
14
24
52
5
18
30
70
6
22
36
92
7
27
43
120
8
31
51
161
9
36
60
230
10
40
69
>230

 
 表3 大肠菌群数变异不大的饮用水

阳性管数
0
1
2
3
接种水样总量300mL(3份100 mL)
每升水样中大肠菌群数
<3
4
11
>18

 
表4 大肠菌群检索表(严重污染水)

接种水样量/mL
每升水样中大肠菌群数
备注
1
0.1
0.01
0.001
-
-
-
-
<900
接种水样总量为1.111(1,0.1,0.01,0.001mL各一份)
-
-
-
+
900
-
-
+
-
900
-
+
-
-
950
-
-
+
+
1800
-
+
-
+
1900
-
+
+
-
2200
+
-
-
-
2300
-
+
+
+
2800
+
-
-
+
9200
+
-
+
-
9400
+
-
+
+
18000
+
+
-
-
23000
+
+
-
+
96000
+
+
+
-
238000
+
+
+
+
>238000

 
 表5大肠菌群检索表(中度污染水)
 

接种水样量/mL
每升水样中大肠菌群数
备注
10
1
0.1
0.01
-
-
-
-
<90
接种水样总量为11.11(10,1,0.1,0.01 mL各一份)
-
-
-
+
90
-
-
+
-
90
-
+
-
-
95
-
-
+
+
180
-
+
-
+
190
-
+
+
-
220
+
-
-
-
230
-
+
+
+
280
+
-
-
+
920
+
-
+
-
940
+
-
+
+
1800
+
+
-
-
2300
+
+
-
+
9600
+
+
+
-
23800
+
+
+
+
>23800

 
 表6大肠菌群检索表(轻度污染水)

接种水样量/mL
每升水样中大肠菌群数
备注
100
10
1
0.1
-
-
-
-
<9
接种水样总量为111.1(100,10,1,0.1mL各一份)
-
-
-
+
9
-
-
+
-
9
-
+
-
-
9.5
-
-
+
+
18
-
+
-
+
19
-
+
+
-
22
+
-
-
-
23
-
+
+
+
28
+
-
-
+
92
+
-
+
-
94
+
-
+
+
180
+
+
-
-
230
+
+
-
+
960
+
+
+
-
2380
+
+
+
+
>2380

 
表7 大肠菌群变异不大的水源水

阳性管数
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
每升水样中大肠菌群数
<10
11
22
36
51
69
92
120
160
230
>230
备注
接种水样总量100mL(10mL10份)

操作步骤同生活用水或食品生产用水的检验。同时应注意,接种量1mL及1mL以内用单倍乳糖胆盐发酵管;接种量在1mL以上者,应保证接种后发酵管(瓶)中的总液体量为单倍培养液量。然后根据证实有大肠菌群存在的阳性管(瓶)数,查表4、表5、表6或表7,报告每升水样中的大肠菌群数(MPN)。
    附:滤膜法
    滤膜法所使用的滤膜是一种微孔滤膜。将水样注入已灭菌的放有滤膜的滤器中,经过抽滤,细菌即被均匀地截留在膜上,然后将滤膜贴于大肠菌群选择性培养基上进行培养。再鉴定滤膜上生长的大肠菌群的菌落,计算出每升水样中含有的大肠菌群数(MPN)。
    (1)准备工作:
        1)滤膜灭菌:
将3号滤膜放入烧杯中,加入蒸馏水,置于沸水浴中蒸煮灭菌3次,每次15min。前两次煮沸后需换无菌水洗涤2-3次,以除去残留溶剂。
    2)滤器灭菌:准备容量为500mL的滤器,用点燃的酒精棉球火焰灭菌,也可用121℃高压灭菌20min。
     3)培养:
将品红亚硫酸钠培养基放入37℃培养箱内预温30-60min。
    (2)过滤水样:
    1)用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分,将粗糙面向上贴放于已灭菌的滤床上,轻轻地固定好滤器漏斗。水样摇匀后,取333mL注入滤器中,加盖,打开滤器阀门,在—50kPa压力下进行抽滤。
    2)水样滤完后再抽气约5s,关上滤器阀门,取下滤器,用无菌镊子夹取滤膜边缘部分,移放在品红亚硫酸钠培养基上,滤膜截留细菌面向上与培养基完全紧贴,两者间不得留有间隙或气泡。若有气泡需用镊子轻轻压实,倒放在37℃培养箱内培养16-18h。
    (3)结果判定:
    1)挑选符合下列特征的菌落进行革兰氏染色,镜检。
    ①紫红色,具有金属光泽的菌落。
②深红色,不带或略带金属光泽的菌落。
   ③淡红色,中心颜色较深的菌落。
    2)凡是革兰氏阴性无芽胞杆菌,需再接种于乳糖蛋白胨半固体培养基,37℃培养6-8h,产气者,则判定为大肠菌群阳性。
    3)1L水样中大肠菌群数等于滤膜法生长的大肠菌群菌落数乘以3。

 

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