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水中细菌总数的测定和大肠菌群的检测(1)



录入时间:2010-9-25 11:17:29 来源:生物信息网

(一)实验目的
    (1)了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测定意义。
    (2)学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法。
    (3)学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。
(二)实验原理
    水是微生物广泛分布的天然环境。各种天然水中常含有一定数量的微生物。水中微生物的主要来源有:水中的水生性微生物(如光合藻类)、来自土壤径流、降雨的外来菌群和来自下水道的污染物和人畜的排泄物等。水中的病原菌主要来源于人和动物的传染性排泄物。
    水的微生物学的检验,特别是肠道细菌的检验,在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义,同时也是评价水质状况的重要指标。国家饮用水标准规定,饮用水中大肠菌群数每升中不超过3个,细菌总数每mL不超过100个。
    所谓细菌总数是指1mL或1g检样中所含细菌菌落的总数,所用的方法是稀释平板计数法,由于计算的是平板上形成的菌落(colony-forming unit,cfu)数,故其单位应是cfu/g(mL)。它反映的是检样中活菌的数量。
    所谓大肠菌群,是指在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称,主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成,即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。
    水的大肠菌群数是指100mL水检样内含有的大肠菌群实际数值,以大肠菌群最近似数(MPN)表示。在正常情况下,肠道中主要有大肠菌群、粪链球菌和厌氧芽胞杆菌等多种细菌。这些细菌都可随人畜排泄物进入水源,由于大肠菌群在肠道内数量最多,所以,水源中大肠菌群的数量,是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。目前,国际上已公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标。因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。
   水中大肠菌群的检验方法,常用多管发酵法和滤膜法。多管发酵法可运用于各种水样的检验,但操作繁琐,需要时间长。滤膜法仅适用于自来水和深井水,操作简单、快速,但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样。
(三)实验器材
(1) 菌落总数的测定:
1)培养基:牛肉膏蛋白胨琼脂培养基,无菌生理盐水。
2)器材:灭菌三角瓶,灭菌的具塞三角瓶,灭菌平皿,灭菌吸管,灭菌试管等。
(2)大肠菌群的测定;
    1)培养基:
    ①乳糖胆盐蛋白胨培养基:
    蛋白胨20g,猪胆盐(或牛、羊胆盐)5g,乳糖10g,0.04%溴甲酚紫水溶液25mL,水1000mL,pH7.4。
    制法:将蛋白胨、胆盐从乳糖溶于水中,校正pH,加入指示剂,分装,每瓶50mL或每管5mL,,并倒置放入一个杜氏小管,l15℃灭菌15min。
    双倍或三倍乳糖胆盐蛋白胨培养基:除水以外,其余成分加倍或取三倍用量。
    ②伊红美蓝琼脂培养基:
    蛋白胨10g,乳糖10g, K2HP04 2g, 2%伊红水溶液20Ml,0.65%美蓝水溶液lOmL,琼脂17g,水1000mL,pH7.1。
    制法:将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶于水中,校正pH后分装.121℃灭菌15min备用。临用时加入乳糖并熔化琼脂,冷至50-55℃,加入伊红和美蓝溶液,摇匀,倾注平板。
    ③乳糖发酵管:
    除不加胆盐外.其余同乳糖胆盐蛋白胨培养基。
    2)器材:灭菌三角瓶,灭菌的具塞三角瓶,灭菌平皿,灭菌吸管,灭菌试管等。
四)实验方法
 (1)水样的采集:
   1)自来水:先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌,再开放水龙头使水流5min,以灭菌三角瓶接取水样以备分析。
    2)池水、河水、湖水等地面水源水:在距岸边5m处,取距水面10-15cm的深层水样,先将灭菌的具塞三角瓶,瓶口向下浸入水中,然后翻转过来,除去玻璃塞,水即流入瓶中,盛满后,将瓶塞盖好,再从水中取出。如果不能在2h内检测的,需放入冰箱中保存。
    (2)细菌总数的测定:
    1)水样稀释及培养:
    ①按无菌操作法,将水样作10倍系列稀释:
    ⑦根据对水样污染情况的估计,选择2-3个适宜稀释度(饮用水如自来水、深井水等,一般选择1、1:10两种浓度;水源水如河水等,比较清洁的可选择1:10、1:100、1:1000三种稀释度;污染水—被选择1:100、1:1000、1:10000三种稀释度),吸取1mL稀释液于灭菌平皿内,每个稀释度作3个重复。
    ③将熔化后保温度45℃的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平皿,每皿约15mL,并趁热转动平皿混合均匀。
    ④待琼脂凝固后,将平皿倒置于37℃培养箱内培养24±1h后取出,计算平皿内菌落数目,乘以稀释倍数,即得1mL水样中所含的细菌菌落总数。
    2)计算方法:
    作平板计数时,可用肉眼观察,必要时用放大镜检查,以防遗漏。在记下各平板的菌落数后,求出同稀释度的各平板平均菌落数。
 3)计数的报告:
 ①平板菌落数的选择:
    选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个重复时,应选取两个平板的平均数。如果一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板计数作为该稀释度的菌数。若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,可计算半个平板后乘2以代表整个平板的菌落数。
    ②稀释度的选择:
a. 应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度,乘以该稀释倍数报告之(表1例1)。
b.若有两个稀释度,其生长的菌落数均在30-300之间,则视二者之比如何来决定。若其比值小于2,应报告其平均数;若比值大于2,则报告其中较小的数字(l例2、例3)。
c.若所有稀释度的平均菌落均大于300,则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(l例4)。
d.若所有稀释度的平均菌落数均小于30、则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(1例5)。
e. 若所有稀释度均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数报告之(表1例6)。
    f. 若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间,则以最接近30或300的平均菌落数乘以该稀释倍数报告之(表l例7)。
    ③细菌总数的报告:
    细菌的菌落数在l00以内时,按其实有数报告;大于100时,用二位有效数字,在二位有效数字后面的数字,以四舍五入方法修约。为了缩短数字后面的0的个数,可用10的指数来表示,如表1“报告方式”一栏所示。
 
(3)大肠菌群的测定(多管发酵法):
表 1 稀释度的选择及细菌数报告方式
 
 
稀释度及菌落数
两稀释度之比
菌落总数/(cfu/g或cfu/mL)
报告方式(菌落总数)/(cfu/mL或cfu/g)
 
10-1
10-2
10-3
 
1
多不可计
164
20
-
16400
16000或1.6×104
2
多不可计
295
46
1.6
37750
38000或3.8×104
3
多不可计
271
60
2.2
27100
27000或2.7×104
4
多不可计
多不可计
313
-
313000
310000或3.1×105
5
27
11
5
-
270
270或
6
0
0
0
-
<10
<10
7
多不可计
305
12
-
30500
31000或3.1×104

 

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