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环境中微生物的检测(2)



录入时间:2010-9-21 10:36:37 来源:青岛海博

 

1.2水体中的微生物

水体可分为天然水体和人工水体。天然水体包括海洋、江河、湖泊等;人工水体包括水库、运河、城市排水系统、各种污水处理系统等。水体中含有微生物所需的各种营养,因而也是微生物的天然生境。水体中微生物除天然栖息者外,还有来自土壤、空气、动植物残体、动物排泄物、各类工业废水和生活污水中的微生物,其中包括某些病原微生物。

1.2.1水中微生物的种类、分布

由于各水域中营养物质的组成、浓度、水温、溶解氧的差异及微生物的来源不同,因此其种类、数量差异很大。

1.2.1.1 微生物的种类

1)清水型水生微生物

在洁净的水域中,因营养物较少,微生物数量也较少。在每毫升水中一般只含几十个到几百个细菌,并以自养型种类为主。常见的细菌有绿硫细菌、紫色细菌、蓝细菌、柄细菌、赫色纤毛菌、球衣细菌和萤光假单胞菌等。此外,还有许多藻类(如丝状绿藻、硅藻等)、真菌(水霉菌属和绵霉菌属)、原生动物(如钟虫及其他固着型纤毛虫等)和后生动物(如枝角类、桡足类等)。

2)腐败型水生微生物

在受到有机物严重污染的水域中,数量较多的是细菌,每毫升水中可达几千万个甚至几亿个,以异养菌为优势。异养菌分解有机物,起重要的净化作用。常见的微生物中,细菌以变形杆菌、产气肠杆菌、产气碱杆菌、等革兰氏阴性无芽孢菌为主,此外还有芽孢杆菌、生孢梭菌、大肠杆菌、粪链球菌、弧菌、螺菌、假单胞菌,有的甚至还含有伤寒、痢疾、霍乱等病原体;藻类有绿藻、裸藻等;原生动物有草履虫、屋滴虫、小口钟虫等。

1.2.1.2 微生物的分布

影响微生物在水体中分布的因素有:水体类型、污染程度、有机物的含量、溶解氧量、水温、pH及水深等。

微生物在水体中的水平分布规律为:近岸水域中细菌数量较多,离岸越远的地方,微生物越少;底泥中的细菌多于水中的细菌。

微生物在较深较大的静水水域中的垂直分布规律是:在上层水体中(水面下0~10m深处),氧含量较高,主要有好氧细菌(如假单脆菌、柄杆菌、球衣细菌等)、真菌和藻类;中层水体(水深20~30m)主要有光合细菌(如红硫细菌和绿硫细菌)以及厌氧细菌;底层水体中(30m以下及湖底泥),主要有脱硫弧菌属、甲烷杆菌属和甲烷球菌属等厌氧细菌。微生物的数量以5~10m深处为最多,随着深度的增加而减少。

地下水由于经过土壤过滤、有机物缺乏,故含菌量远远少于地面水,在深层地下水中甚至没有细菌。

1.2.2 水的细菌学检测

1.2.2.1 细菌总数(CFU)的测定

细菌总数是将定量水样(原水样或作一定稀释后水样1mL)接种在普通营养琼脂培养基内,于37培养24h后观察结果,计数其上长出的细菌菌落数,然后换算求出原水样每mL中所含的细菌数。

其测定步骤和土壤中微生物的分离计数方法基本相同,但须注意:①水样是用无菌采样瓶直接采取水样;②水样接种于营养琼脂培养基中,在37下培养24h;

37营养琼脂培养基中能生长的细菌,代表在人体温度下能繁殖的异养型细菌。细菌总数越多,说明水被有机物或粪便污染越重,被病原菌污染的可能性也越大。

在生活饮用水中所测得的细菌总数,除说明水被生活废弃物污染的程度外,还可指示该水能否饮用。可在生活饮用水进行卫生学评价时提供依据。

我国生活饮用水标准(GB5749-85)规定,细菌总数不得超过100/ml。

一般认为在天然水体中,如10100/mL,为极清洁的水;1001000/mL,为清洁的水;100010000/mL,为不太清洁的水;10000100000/mL,为不清洁的水;大于100000/mL,为极不清洁的水。

1.2.2.2 大肠菌群的测定

天然水体的细菌性污染主要源于生活污水中的粪便,即水中的病原菌很可能是肠道传染病的病原。通常情况下,水中病原菌的含量极少,而细菌种类却很多,需要耗费大量的人力、物力及复杂的分离培养技术,才能将病原菌一一检测出来。最常见的数量极大的大肠菌群与病原菌同样来自于动物粪便,根据这一点,只要通过检查水样中的指示菌――大肠菌群,即可知道该水体被粪便污染的程度,从而间接推测其他病原菌存在的概率。

大肠菌群是指那些能在37下,24~48h之内使乳糖发酵并产酸产气、好氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。主要包括大肠埃希氏菌、产气杆菌、枸橼酸盐杆菌、副大肠杆菌。

大肠埃希氏菌即大肠杆菌是人和温血动物肠道中的正常细菌,兼性好氧的革兰氏阴性、无芽孢、两头钝圆的杆菌,大小0.5~0.8mm×2.0~3.0mm;最适温度37,最适的pH为中性;能分解葡萄糖、甘露醇、乳糖等多种碳水化合物,并产酸产气。大肠菌群的各类细菌的生理习性都相似,只是副大肠杆菌不分解或缓慢分解乳糖。在远滕氏培养基(品红亚硫酸钠培养基)或伊红美蓝培养基表面会形成具有特殊现象的菌落,大肠埃希氏杆菌的菌落呈紫红色带金属光泽;枸橼酸盐杆菌的菌落呈紫红或深红色;产气杆菌的菌落呈淡红色,中心色深;副大肠杆菌的菌落则无色透明。这些现象可作为鉴别的依据。

大肠菌群的检验方法有发酵法和滤膜法。发酵法是测定大肠菌群的基本方法,包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。

1)初发酵试验

发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基,并倒置一小倒管。乳糖能起选择作用,因为很多细菌不能发酵乳糖,而大肠菌群能发酵乳糖并产酸产气。为便于观察细菌的产酸情况,培养基内加有溴甲酚紫作为pH指示剂。细菌产酸后,培养基即由原来的紫色变为黄色,溴甲酚紫还能抑制其他细菌如有芽胞的细菌生长。

水样接种于发酵管内,37下培养,24h内小倒管中有气体形成,并且培养基混浊,颜色黄,说明水中存在大肠菌群,为阳性结果。对于只产酸不产气的,不能说明是阴性结果,因为在菌量少的情况下,可能延迟至48h后才产气,此时应视为可疑结果。需继续做下面两部分实验,才能确定是否是大肠菌群。既不产酸又不产气的,为阴性结果。

2)平板分离

平板培养基一般使用远藤氏培养基或伊红美蓝琼脂培养基,前者含有碱性品红染料,在此作为指示剂,它可被培养基中的亚硫酸钠脱色,使培养基呈淡粉红色,大肠菌群发酵乳糖后产生的酸和乙醛立即与品红反应,形成深红色复合物,使大肠菌群菌落变为带金属光泽的深红色。亚硫酸钠还可抑制其他杂菌的生长。伊红美蓝琼脂培养基则含有伊红与美蓝染料,在此亦作为指示剂,大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时,该两种染料即结合成复合物,使大肠菌群产生与远藤氏培养基上相似的、带核心的、有金属光泽的深紫色菌落。

将培养24h后产酸产气或只产酸的发酵管,分别划线接种在平板上。经过37培养24h,挑取典型的大肠菌群菌落,进行革兰氏染色,镜验后若呈阴性,则可认为有此类细菌存在。为了更进一步验证,可做下一步实验。

3)复发酵实验

将染色为革兰氏阴性、无芽胞杆菌的菌落再移植于乳糖培养基中,原理与初发酵试验相同,经24h培养产酸又产气的,最后确定为大肠菌群阳性结果。

根据发酵阳性管的数量,以确定大肠菌群数。

除查表外,也可以用计算法求出大肠菌群数。即根据初发酵的发酵管数、大肠菌群阳性管数及检测水样量,利用数理统计原理,计算出每升水样中大肠菌群的最近似数(MPN)。

为了区别土壤等自然环境中原本存在的大肠菌群及来源于人粪便中的大肠菌群,可以通过提高培养温度至44.5℃的方法将它们区分开。凡能在44.5℃生长并发酵乳糖产酸产气的,说明主要来自粪便,称之为“粪大肠菌群”;如果能在37℃生长并发酵乳糖产酸产气者,则称之为“总大肠菌群”。
总大肠菌群数是指每升水样中所含有的大肠菌群的数目。水中大肠菌群的多少,可以反映水体被粪便污染的程度,并间接地表明肠道致病菌存在的可能性。
许多不同用途的水都对细菌总数或大肠菌群数提出了要求。表1.1是我国用途不同的水质标准。
表1.1 各种用途的水质标准
标准名称及标准编号
项目
标准值
生活饮用水卫生标准
GB5749-85
细菌总数(个/mL)
≤100
总大肠菌群(个/L)
≤3
生活饮用水源水质标准
CJ3020-93
总大肠菌群(个/L)
一级≤1000
二级≤10000
地表水环境质量标准
GB3838-2002
粪大肠菌群(个/L)
Ⅰ≤200    Ⅱ≤2000  Ⅲ≤10000 
Ⅳ≤20000  Ⅴ≤40000
地下水质量标准
GB/T14848-93
细菌总数(个/mL)
Ⅰ~Ⅲ≤100   Ⅳ≤1000  Ⅴ﹥1000
总大肠菌群(个/L)
Ⅰ~Ⅲ≤3     Ⅳ≤100   Ⅴ﹥100
景观娱乐用水水质标准
GB12941-91
总大肠菌群(个/L)
粪大肠菌群(个/L)
A类≤10000
A类≤2000
农业灌溉水质标准
GB5084-92
粪大肠菌群(个/L)
≤10000
渔业水质标准
GB11107-89
总大肠菌群(个/L)
≤5000
≤500(贝类养殖水质)
海水水质标准
GB3097-1997
总大肠菌群(个/L)
≤10000
≤700(贝类养殖水质)
注:GB国家强制标准,CJ城镇建设行业标准。
 
 
 

 

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