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《水生微生物实验法》——不同类型微生物的分离方法(7)



录入时间:2010-9-9 17:15:29 来源:青岛海博

 

(七)硫杆菌的分离培养

硫杆菌属 ,能使硫或硫酐的不完全氧化物转化成硫酸等物质,并参与水中和土壤中硫的循环作用.使土壤和水质改良.当水中积累硫化氢等有毒物质时.可在硫杆菌的作用下转化为无毒物质,利于水产养殖.

硫杆菌在海水、淡水、海泥、池泥及其他土壤中广泛分布。具有代表性的有排硫杆菌、氧化硫杆菌和脱氮硫杆菌等。

1 .排硫细菌的富集培养与分离

此种细菌能在添加硫化钾或硫代硫酸钠.而无有机碳源的海水中生长.少许有机物也不抑制其生长.但在没有二氧化碳及碳酸盐情况下不能生长。在大量硫化物存在下,硫化物被氧化成硫沉淀于细胞外,此种细菌能氧化硫元素,但较嗜好氧化硫化物、硫代硫酸盐或四硫磺酸盐.氧化不同的硫化物,产物也不同,视作用物的浓度、pH 、En而定.

1)培养基制备.

Na2S2O3·5H2O    2

K2HPO4    0.8

KH2PO4    0.5

NH4Cl    0.08

MgSO4    0.16

FeSO4    微量

MnSO4    微量

    200 毫升

pH  7-7.8

此培养基选择性强,可不必灭菌。其固体培养基用双倍用量加2-3 琼脂及等量的水制成平板培养基,用紫外线消毒即可。培养基中的微量组分,预先配成稀的水溶液,先滴l 滴在培养皿或锥形瓶中与培养基混匀.

2)富集培养:将已配制液体培养基分装于4 150毫升的锥形瓶中,取不同站位的粘海泥或池泥、河泥2-3 ,分别接种于装有培养基的瓶中,每个样品接种2 瓶,振荡均匀。在25-30 下培养3-4 天。此后培养液变酸,变浊,一星期内,pH 7.3 降为3 .则可估计出培养液中的排硫杆菌繁殖起来已占优势.

3)分离培养:挑各瓶培养液分别接种于相应编号的平板培养基上,加1 滴无菌水,用曲玻棒涂匀,倒放培养皿于25-30 中培养1-2 天,若出现不透明的白色或浅黄色的菌落则继续培养,较大的菌落中央呈橙色小圆点。如不纯,可挑选具有这些特征的菌落作涂板纯化,菌落为圆形,大小约0.2 毫米.全缘,由于有硫粒的积集,内部呈粗粒状结构。

4)显微观察:呈细短杆菌,大小为0.5×1-3 微米,无孢子,能运动,呈革兰氏阴性反应。

若备有上述各种特点者可初步应定为纯的排硫细菌。

2 .氧化硫杆菌的富集培养与分离

此种细菌能氧化硫元素为硫酸盐:

① 培养基制备:

硫黄末   2

(NH4)2SO4  0.04

KH2PO4    0.8

MgSO4·2H2O  0.10

CaCl2  0.05

FeSO4   微量

200 毫升

pH 2-3.5

将上述成分溶于水中混匀后,加克分子浓度的磷酸若干,使pH 降至3 左右。由于培养基的酸度高可不需要灭菌,同样用双倍浓度上述成分(也即将水减至100 毫升)加2-3 琼脂制成平板。

(2)富集培养:按排硫杆菌的培养方法和条件进行.因海泥是微碱性的使pH 提高到5.2 左右,培养2-3 天或更长时间后,培养液出现混浊现象,变酸。一周后pH 5.2 降至3.7 ,二周后pH 变为2 或更低些,由此可故计这种氧化硫杆菌在培养液中已有大量繁殖。取此培养液少许重复富集培养2-3 次,可获得更大量氧化硫杆菌供分离之用.

3)分离纯化培养:在已重复富集培养数次的培养液中加硫酸溶液使pH 降至1 或更低些,借此淘汰杂菌,以纯化氧化硫杆菌。

4)各取少许上述培养液分别在平板培养基上涂板,并按排硫杆菌的培养条件与方法培养l-2 天后观察菌落形态。

5)显微观察:细短杆菌,大小约为0.5×1.0微米,菌体两端圆形,单一。成双或呈短链排列,无孢子,革兰氏染色阴性反应.运动活泼.

符合上述特征者,所分离的细菌可初步确定为氧化硫杆菌。

3 .脱氮硫杆菌的富集与分离

1)培养基制备:

Na2S2O3·5H2O    1.0

K2HPO4   0.4

KNO3      0.4

NaHCO3  0.2

MgSO4·7H2O   0.12

NH4Cl  0.1

FeSO4·7H2O    0.002

     200毫升

pH    7-7.6

固体培养基用双倍浓度(即将减至100 毫升)加琼脂2-3 ,可用紫外线灭菌。

2)富集培养:按排硫杆菌的培养方法和条件进行,2-3 天后培养液出现均匀混浊,并有气体从瓶底的沉淀物中陆续上升,由此二种现象可估计培养液中己繁殖不少的脱氮流杆菌,分别将此培养液逐个倾出后,再用新的培养液充满培养瓶,如此重复直至倾入新培养液时,立即见气体从瓶底培养物中逸出,至此可认为培养液中已有足够多的培养菌。

3)分离纯化培养.按排硫细菌分离方法把培养液分别接种于相应编号的平板培养基上,颠倒平板与焦性没食子酸同时放入干燥器中,抽出空气,充以CO2,培养1 周左右.观察菌落形态为半透明的圆形小菌落时,取少许菌落重复子平板培养基上作纯化培养。

4)显微观察:细小杆菌,大小为0.5×1-3 微米,革兰氏染色阴性.无孢子,能运动。

能观察到上述各种特征者,可初步确定为脱氮硫杆菌。

 

 

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