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国产MH琼脂质量控制的探讨



录入时间:2010-9-6 13:38:29 来源:上海预防医学杂志

MH琼脂( M u l l e r   H i n t o n   A g a r ) 是至今被国际公认和 WHO推荐的最适用于琼脂纸片扩散法 ( K i r b y--B a n e r 纸片扩散法) 测定细菌对抗生素敏感性的培养基。究其原因,主要由于MH琼脂培养基产品批间药物敏感试验重复性比其他培养基好;接种于 MH琼脂培养基上, 绝大多数致病菌生长良好;MH琼脂培养基对磺胺、甲氧苄胺嘧啶、四环素的抑制成分含量低。国内外有关药物敏感试验的大量数据是由 M H琼脂作为培养基试验得出的。 
1   国产MH琼脂培养基作为药敏试验培养基使用存在的主要问题
1.1 批间产品的稳定性
国产MH琼脂培养基批间产品稳定性不够,主要是MH琼脂中主要原料的质量不稳定性造成的:①酸水解酪蛋白( C a s e i n  Hydrolysate ) ,水解工艺的不稳定性。②牛肉浸出粉( Beef , Dehydrated  infusion From) ,混有经酶消化的牛肉膏粉。③琼脂,去除游离的矿物质,才能保证药敏试验的结果。琼脂的凝胶强度及在培养基中的浓度均能影响药物的扩散 。④培养基碱性增加能扩大氨基糖苷类药物的抑菌圈。酸性增加能扩大四环素的抑菌圈。MH琼脂一般pH为7.2~ 7.4,接近人体体液的p H值。
1 .2 拮抗物质
MH琼脂原料中存在过量的被测药物的拮抗物质:① 胸腺嘧啶核苷( Thymidine )胸腺嘧啶( Thymine ) 抑制磺胺类药和甲氧苄胺嘧啶的活力。胸腺嘧啶核苷对TMP的抑制是胸腺嘧啶的10倍。② MH琼脂中胸腺嘧啶和胸腺嘧啶核苷水平是否足够低, 是否在合格范围内, 美国国立临床实验室标准委员会( NCCLS ) 规定可用 TMP—SMZ纸片鉴定,它对粪肠球菌 ATCC 29212的抑菌圈直径应 ≥2 0 m m, 且边缘清晰,这是检测 MH琼脂是否合格的标准之一( 表 1 ) 。 
 
表1 标准菌株在6种MH琼脂上对TMP-SMZ的抑菌圈50次测试平均值和测试范围(mm) 平均值用X表示
 
MH琼脂产地
粪肠球菌ATCC29212
金黄色葡萄球菌ATCC25923
大肠埃希菌ATCC25922
X
Xmin- Xmax
X
Xmin- Xmax
X
Xmin- Xmax
美国Difco公司
26.06
24.8-27.7
29.48
28.0-31.0
29.88
28.2-31.8
英国Oxoid公司
29.44
28.5-30.5
30.02
27.5-31.7
31.10
29.1-32.0
国产(1)
6.00
29.50
 
27.0-31.5
27.90
26.3-31.5
国产(2)
12.00
11.6-14.0
25.50
24.5-27.0
26.60
24.5-31.0
国产(3)
18.08
17.2-20.5
30.40
28.2-31.0
31.20
26.5-32.0
自配
19.88
18.5-22.0
30.36
27.6-32.0
31.18
26.0-31.5
 
 
 
2 0 0 7年上海市疾控中心培养基室用 3株标准菌株在不同批次自配 M H琼脂上对 T M P—S MZ进行了抑菌圈测试,结果见表2 。自配 MH琼脂对粪肠球菌 ATCC29212的平均抑菌圈为20.5 m m,表明原料中胸腺嘧啶和胸腺嘧啶核苷的含量是基本合格的。3株标准菌株抑菌圈的变异系数( CV) 均小于5 %, 表明国产自配MH琼脂的稳定性还是可以的。 
表2   标准菌株在不同批次自配MH琼脂上对TMP-SMZ的抑菌圈测试结果(mm)
自配MH琼脂批次
粪肠球菌ATCC29212
金黄色葡萄球菌ATCC25923
大肠埃希菌ATCC25922
20070108
18.8
28.4
28.4
20070205
20.4
29.2
30.1
20070305
21.5
28.2
29.3
20070402
19.9
27.8
28.7
20070507
19.7
29.2
29.5
20070604
20.8
30.2
28.6
20070702
21.3
31.3
29.2
20070806
21.8
29.7
30.0
`X±S
20.5±1.0
29.2±1.1
29.2±0.6
CV%
4.9
3.8
2.1
 
 
1.3二价离子
Mg2+  、Ca2+在培养基中的浓度变化,影响四环素、多粘菌素、氨基糖苷类药物的抗菌活性。含量过高,使抑菌圈变小;含量过低,使抑菌圈变大。特别对铜绿假单胞菌的敏感性影响较大。一般认为,1000  mL培养基中Ca2+  50~200 mg , Mg2+  20~35 mg较为适宜。Cu2+、 Zn2+ 、 Sn2+在培养基中只要微量存在,青霉素就会很快分解成青霉素噻唑酸而失去抗菌活性。SO42- ,琼脂中极易残存此子, 其可与多粘菌素、新霉素等药物发生化学反应, 从而影响药物的扩散和抗菌活性  。 
1.4其他
氨基甲酸乙脂( Urethane )、叶酸、葡萄糖、某些蛋白胨和氨基酸对磺胺类药均有不等的拮抗作用。 
2 干扰 MH琼脂质量的外界因素
2.1药敏纸片 
标准纸片直径为1/4时 ( 约6.35mm) ,重量为 ( 30± 4 ) mg/cm2 ,吸水性为重量的2.5~ 3.0倍, pH= 7.0 ,无影响抗菌活性的二价离子。抗生素含量必须符合 NCCLS规定的浓度。长期保存应置于 -2 0 ℃以下低温冰箱。使用前应将使用量纸片置 0 ~ C预温  。 
2.2 细菌接种量
细菌接种量是控制试验重复性的主要因素。一般接种量是0.5麦氏单位的菌液约0.1mL 。加大菌量可使抑菌圈缩小, 反之能使抑菌圈扩大 。 
2.3 平皿制备与保存
9.0 c m平皿倾注培养基一般为 25~ 30 mL , 15cm平皿为60 mL, 厚度均应达4mm。如大量配制应对产品抽样,于3 0~ 35℃, 24 h作无菌试验培养。平皿应置于密封塑料袋内放入冰箱, 2~7℃保存。有效期为7 d。 
2 .4 培养温度和时间
最佳培养温度为 35℃, 培养时间为16~18 h 。温度偏低细菌所需生长时间延长,造成抑菌圈变大; 温度超过 35℃, 可使某些抗生素如:苯唑青霉素、甲氧苯青霉素等失效。有学者发现,在35℃培养时,对甲氧苯青霉素耐药的金黄色葡萄球菌在 3 7 ℃时可不显示耐药  。 
3 推荐的 MH琼脂质控方法
3.1培养基制备
按干粉培养基说明,正确称量和加蒸馏水或去离子水。煮沸溶解后,置 121℃ 15 mi n灭菌。冷至5 5℃左右, 倾注无菌平皿。9c m平皿约2 5~ 3 0 m L ,达到厚度4 m m。MH琼脂最终 pH在 2 5 ℃应为7.2~ 7.4   。 
3.2 常用质控菌株
粪肠球菌 AT C C   2 9 2 1 2; 大肠埃希菌 A T C C   2 5 9 2 2;
金黄色葡萄球菌 A T C C   2 5 9 2 3 ; 铜绿假单胞菌 A T C C   2 7 8 5 3 。 
3.3 质控菌株的保存
短期保存 ,可用胰蛋白胨大豆琼脂斜面 ,4~8 ℃保存, 每周传代 1 次。长期保存, 可将菌株置于合适的稳定性强的保菌培养基中( 如含50 %胎牛血清或脱纤维羊血的胰蛋白胨大豆肉汤, 亦可用含 1 0 % ~1 5 %甘油的胰蛋白胨大豆肉汤) , 保存于 -2 0 ℃或更低温度条件下 。另外,还可用真空冻干方法保存。每月至少用冷冻或冻干菌株更换一次质控菌株。 
3.4 工作悬液制备
从 T S A平皿上挑取3~5个形态相似的菌落顶端部分接种 MHB或 T S B培养基。经 3 5℃培养 4~ 6 h 后 ,用无菌生理盐水稀释至标准比浊管相同浊度 ( 0.5麦氏单位即约 1.5×1 08  C F U/m L ) 。或用法国生物梅里埃A T B比浊仪比浊至 0.5麦氏单位。标准比浊管的配方:0.04 mo L/L  BaC1 2( 1.175 % W/V  BaCl 2   2 H2O)0.5 m L,0.7 2 mol /L H2SO4 99.5m L 。0.5麦氏浊度标准管质控,应每月用分光光度计测吸光度,OD值应在0.08~ 0.1 0之间 。 
3.5 试验步骤
将药敏纸片、MH平皿从冰箱拿出,预温至室温。接种:用无菌棉拭浸取比浊好的菌液, 在管壁内轻轻转压除去过多菌液,然后再轻轻涂抹受检和对照培养基,每一平皿涂抹3次。每次涂抹后均需将平皿转动6 0度,再行下一次涂抹。目的使细菌呈融合的菌苔生长。每一质控菌 株涂抹3只平皿 。贴片: 接种后的平皿置室温片刻, 待稍干后 ,用无菌镊子将抗生素纸片均匀贴布于平皿琼脂表面。各纸片间中心间距不得 < 2 4mm , 纸片距平皿边不得 < 1 5 min 。一旦纸片接触琼脂表面,即不可再移动,因此时药物已开始扩散。应在15 m i n内完成药敏纸片的放置。培养 , 纸片贴妥后,在 15~ 3 0 m i n内,将平皿翻过来 置于3 5℃ 培养 1 6~1 8 h后, 观察结果。平皿培养时不宜堆放 , 以2个相叠为宜  。观察结果,在反射光下,用精确至 1/ 1 0 mm的卡尺测量抑菌圈。MH琼脂质控参考标准见表 3 。 
表3   MH琼脂质控参考标准
抗生素名称
纸片抗生素(mg)
大肠埃希菌抑菌圈(mm)
铜绿假单胞菌抑菌圈(mm)
金黄色葡萄球菌抑菌圈(mm)
粪肠球菌抑菌圈(mm)
庆大霉素
10
19-26
16-21
19-27
 
羟苄青霉素
100
23-29
18-24
-
 
四环素
30
18-25
-
24-30
 
多黏菌素B
300IU
12-16
11-16
-
 
氯霉素
30
21-27
-
19-26
 
TMP-SMZ
1.25/23.75
24-32
-
24-32
≥20
头孢哌酮
75
28-34
23-29
24-33
 
 

 

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