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    微生物基因表达的调控



    录入时间:2010-8-4 10:26:23 来源:微生物学——沈萍主编

    目前常用的三种体外 DNA 连接方法为:
    ① 用 T4或 E.coli DNA连接酶可连接具有互补粘性末端的 DNA片段;
    ② 用 T4 DNA连接酶连接具有平末端的 DNA 片段;
    ③ 先在 DNA 片段末端加上人工接头,使其形成粘性末端,然后再行连接。
    ④ 将粘性末端补平或修平(用单链酶,如绿豆芽核酸酶)连接
     
    柯斯质粒用于克隆大片段的 DNA分子特别有效,而这种特性对于研究高等生物的基因组十分重要。其特点: 
    1)具有 λ噬菌体的特性:在克隆了外源片段后可在体外被包装成噬菌体颗粒,高效地感染对 λ噬菌体敏感的大肠杆菌细胞。进入寄主的柯斯质粒 DNA分子,按照 λ 噬菌体 DNA的方式环化, 但无法按噬菌体的方式生活,更无法形成子代噬菌体颗粒。 
    2)具有质粒载体的特性:在寄主细胞内如质粒一样进行复制,携带有抗性基因和克隆位点,并具氯霉素扩增效应。 
    3)具有高容量的克隆能力:柯斯质粒本身一般只有 5~7kb左右,而它克隆外源 DNA 片段的极限值竟高达 45kb,远远超过质粒载体及 λ 噬菌体载体的克隆能力。同时,由于包装限制,  柯斯质 粒载体的克隆能力还存在一个最低极限值。  例如,5 kb大小的 柯斯质粒载体,插入的外源片段至少不能小于 30 kb。 
     
    M13是大肠杆菌丝状噬菌体,其基因组为环状 ssDNA,  大小为 6407bp。其生活史为: 
    1)通过性毛感染雄性(F+或 Hfr)大肠杆菌,或通过转染进入雌性大肠杆菌细胞; 
    2)进入细胞后,转变成复制型  (RF)  dsDNA,然后以滚环方式制出 ssDNA。每当复制出单位长度正链,即被切出和环化,并被立即组装成子代噬菌体和以出芽方式(即宿主细胞不被裂解)被释放至胞外。 
    M13克隆载体是对野生型 M13进行改造后建成,其特点是虽然克隆外源 DNA的能力较小,一般只适于克隆 300~400bp 的外源 DNA 片段,但特别适合用于制备克隆基因的单链 DNA。主要被用于制备测序用单链 DNA模板、特异的单链 DNA探针,进行定位诱变等,也可用于噬菌体展示。

     

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