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细菌检验工作的基本技术——肠杆菌科(下)



录入时间:2010-7-14 9:29:19 来源:互联网

二、试验方法(2010.07.14-2
()硝酸盐还原试验
      培养基:
                  蛋白胨    1g
                  硝酸钾    0.1g
蒸馏水    l00ml
将上述成分溶于蒸馏水,校正pH为7.4~ 7.6,分装,高压灭菌121℃15min,冷却后备用。
    试剂:
                  A液:
                         对氨基苯磺酸              0.8g
                         5N醋酸                100ml
                  B液:
                         α-萘胺               0.5g
                         5N醋酸             l00ml
方法:将待检菌接种硝酸盐培养基中,孵育过夜,加入等量A、B液1~3滴,观察结果。
结果:红色为“+”,即还原硝酸盐。
注意点:
    1.培养基不应含亚硝酸盐,以避免假阳性。
2.某些肠杆菌还原硝酸盐的能力很强,还原硝酸盐为亚硝酸盐后,进一步将亚硝酸盐分解为氨、氮、氧化氮,造成假阴性。所以,观察结果时,如无红色出现,应加少量锌粉,仍无色,说明亚硝酸盐进一步分解,硝酸盐反应为阳性。若加锌粉后出现红色,说明锌使硝酸盐还原为亚硝酸盐,而待检菌无还原硝酸盐的能力,即硝酸盐还原试验阴性。
 
()甲基红试验
培养基:
             葡萄糖               0.5g
             多价蛋白胨        0.5g
             磷酸氢二钾        0.5g
             蒸馏水               100ml
将上述成分溶于蒸馏水,校更pH为 7.2,分装,高压灭菌121℃10min,冷却备用。
试剂:甲基红 0.1g溶于95%乙醇 300ml,然后加蒸馏水至500ml。
方法:将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水中,孵育过夜,加甲基红试剂1~2滴,观察结果。
    结果:红色为阳性,桔黄色为阴性。
 
()MIU培养基(动力-靛基质-尿素)
培养基:
             胰蛋白胨                  1g
             NaCl                  0.75g
             磷酸氢二钾        0.2g
             葡萄糖               0.1g
             琼脂                         0.4g
             蒸馏水               l00ml
             0.4%酚红          适量
             20%尿素                  10ml
将上述成分(尿素除外)溶于蒸馏水,加适量0.4%酚红,高压灭菌116℃20min,20%尿素过滤除菌,加入灭菌后的培养基中,分装、备用。
方法:将待检菌穿刺接种于MIU培养基中,孵育过夜,观察结果。
结果:    动力“十”,穿刺线周围扩散生长。
培养基变红为尿素阳性。
                         加靛基质试剂变红为吲哚阳性。
 
()拘橼酸盐试验(Simmons)
培养基:
             氯化钠                             5g
             硫酸镁                             0.2g
          磷酸二氢铵                      1g
                  磷酸氢二钾                      1g
                  枸橼酸钠                                2g
                  蒸馏水                             1000ml
                  0.2%溴麝香草酚蓝            40ml
将上述成分溶于蒸馏水,校正pH7.0,加溴麝香草酚蓝指示剂,高压灭菌121℃ 15min,分装,备用。
方法:将待检菌接种于培养基中,孵育过夜,观察结果。
结果:有细菌生长培养基变蓝色为阳性,无颜色改变为阴性。
    
()氨基酸脱羧试验
    培养基:
                  蛋白胨                             5g
                  酵母浸膏                                3g
                  葡萄糖                             1g
                  溴甲酚紫(1.6%溶液)        lml
                  蒸馏水                             1000ml
                  L—氨基酸                       0.5%
将上述成分(除氨基酸外)溶于蒸馏水,然后加氨基酸,校正pH6.7~6.8,分装,高压灭菌121℃lOmin,备用。用于对照的不加氨基酸。
方法:取待检菌接种于氨基酸脱羧培养基和对照管中,封石腊油,35℃培养过夜,观察结果。
结果:培养基变紫色为阳性,黄色为阴性。对照管应保持黄色。
注意点:
    1.培养基的pH值很重要。
    2.加封石腊油造成厌氧环境。因为在厌氧情况下氨基酸脱羧生成的胺才稳定。
    3.对照管如不呈黄色,则氨基酸脱羧酶试验不能作出判定。
   
()葡萄糖酸盐试验
    培养基:
                  蛋白胨               1.5g
                  酵母浸膏                  1g
磷酸氢二钾       1g
葡萄糖酸钾       40g
蒸馏水              1000ml
上述成分溶解、过滤,校值更pH6.5,分装每管lml,高压灭菌115℃15min,冷却,备用。
试剂:班氏试剂。
大量接种待检菌于培养基中,35℃孵育过夜或至48h,加班氏试剂,水浴中煮沸 lOmin观察结果。
结果:有黄色到橙色出现为“+”,没有颜色变化为“一”。
 
()糖、醇发酵试验
培养基:
             蛋白胨                      l0g
             肉膏                                3g
             氯化钠                      5g
             Andrade指示剂         l0ml
             蒸馏水                      1000ml
将上述成分溶于蒸馏水,加糖或醇,校正 pH7.1~7.2,分装,高压灭菌121℃15min。冷却备用。
葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇的浓度为 1%。其他糖类和卫矛醇、水杨苷等的浓度为 0.5%。
乳糖、蔗糖和阿拉伯糖、木糖、鼠李糖等二糖应过滤除菌,再加入于已灭菌的基础液中。
Andrade指示剂:
             蒸馏水                             l00ml
             酸性复红                                0.5g
             lmol/L氢氧化钠              16ml
将复红溶解于蒸馏水,加入氢氧化钠,数小时后,如复红褪色不够,再加l~2ml氢氧化钠,使呈淡黄色。
方法:接种待检菌,35℃孵育过夜,观察。
结果:培养基变红色为阳性,不变色或黄色为阴性。
 
()苯丙氨酸脱氨试验
培养基:
                  DL-苯丙氨酸    2g    (L-型1g)
                  酵母浸膏                  3g
                  氯化钠               5g
                  磷酸氢二钠        1g
                  蒸馏水               1000ml
将上述成分溶于蒸馏水,分装,高压灭菌 121℃15min,冷却,备用。
试剂:10%三氯化铁溶液。
方法:将待检菌接种于培养基,35℃孵育过夜,加三氯化铁试剂,观察结果。
结果:培养基变绿色为阳性,不变色为阴性。

 

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