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病毒分离前样品的预处理方法



录入时间:2010-3-15 14:35:51 来源:丁香园

病毒含量较高的样品浸出液或体液,可不经过病毒分离直接用于诊断鉴定。病毒含量较少的样品,则需通过病毒的分离增殖来提高诊断的准确性和鉴定的可靠性。病毒分离首先要对样品进行适当的处理,然后接种实验动物或培养的组织细胞。
()组织器官样品的处理
1、用无菌操作取一小块样品,充分剪碎,置乳钵中加玻璃砂研磨或用组织捣碎机制成匀浆,随后加1-2ml Hank's平衡盐溶液制成组织悬液,再加1-2ml继续研磨,逐渐制成10%-20%的悬液;
2、加入复合抗生素;
3、以800×g离心15min;
4、取上清液用于病毒分离。必要时可用有机溶剂去除杂蛋白和进行浓缩(见下文)。
()粪便样品的处理
1、加4g的粪便于16ml Hank's平衡盐容液中制成20%的悬液;
2、于密闭的容器中强烈振荡30min,如果可能则加入玻璃珠;
3、以6000×g低温离心30min,取上清液再次重复离心;
4、用450nm的微孔滤膜过滤;
5、加二倍浓度的复合抗生素,然后直接用于病毒分离或进行必要的浓缩后再行病毒分离。
()无菌的体液(腹水、脊髓液、脱纤血液、水泡液等)和鸡胚液样品 
可不做处理,直接用于病毒分离。
注:Hank's平衡盐溶液和复合抗生素的配制见细胞培养溶液的配制。
()样品的特殊除菌处理 
样品经过上述一般处理即可用于病毒分离,但对某些样品用一般方法难以去除的污染,则应考虑配合如下方法进行处理:
1、乙醚除菌 对有些病毒(如肠道病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、小RNA病毒等)对乙醚有抵抗力,可按冷乙醚:样品=1:1(V:V)加入,悬液充分振荡,置4℃过夜。取用下层水相分离病毒。
2、染料普鲁黄(Proflavin)除菌 由于其对肠道病毒和鼻病毒很少或没有影响,常用作粪或喉头样品中细菌的光动力灭活剂。将样品用0.0001mol/L pH9.0的普鲁黄于37℃作用60min,随后用离子交换树脂除去染料,将样品暴露于白光下,即可使其中已经被光致敏的细菌或霉菌灭活。
3、过滤除菌 可用陶土滤器、瓷滤器、石棉滤器或者200nm孔径的混合纤维素酯微孔滤膜等除菌,但对病毒有损失。
4. 离心除菌 用低温高速离心机以1800r/min(15.24cm)离心20min,可沉淀除去细菌,而病毒(小于100nm)保持在清液中。必要时转移离心管重复离心一次。
()待检样品中病毒的浓缩 
对病毒含量很少的病毒样品用一般普通方法不易检测或分离出病毒,必须经过浓缩。常用浓缩方法如下:
1、聚乙二醇(PEG)浓缩法 将分子量6000的PEG逐步加入经一般处理的样品溶液中,使终浓度为8%,置4℃过夜。以3000×g离心15min,用少量含复合抗生素的Hank's平衡盐溶液重悬,必要时用450nm微孔滤器除去真菌孢子。
2、硫酸铵浓缩法 将等量饱和硫酸铵溶液缓慢加入经过上述一般处理的样品溶液中,边加边搅拌,置4℃过夜。离心同上。
3、超滤器浓缩法 是一种高效率的浓缩法,特别适合大体积的样品浓缩。
4、超速离心浓缩法 以40000r/min(15.24cm)离心60-120min,绝大多数病毒将沉于管底。用少量Hank's平衡盐溶液悬浮病毒。这种方法回收效率很高,但仅适用于小体积的样品。
() 病毒分离样品脂类物质的去除
有些病毒样品(如组织样品)脂类和非病毒蛋白含量很高,必要时在浓缩病毒样品之前可用有机溶剂抽提。常用的有机溶剂有正丁醇、三氯乙烯、氟里昂等。方法是将预冷的等量有机溶剂加入样品中,强烈振荡后,1000×g离心5min,脂类和大量非病毒蛋白将保留在有机相中,病毒保留在水相中。应当注意的是,病毒必须对这些有机溶剂有抗性。
 

 

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