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链霉菌实验操作1



录入时间:2009-8-28 16:09:31 来源:食品科技网

一、培养基、抗生素、生长因子

常用抗生素及其使用浓度

抗生素
英文名称及缩写
抗性基因
贮藏液浓度(mg/ml)
使用终浓度(μg/ml)
链霉菌
大肠杆菌
MM
2CM
YEME
LA或LB
氨苄青霉素
氯霉素
潮霉素
卡那霉素
壮观霉素
链霉素
硫链丝菌素
红霉素
阿泊拉霉素
Ampicillin, Amp          Chloramphenicol, Cml
Hygromycin, Hyg
Kanamycin, Km
Spectinomycin, Spc
Streptomycin, Str
Thiosestrepton, Thio
Erythomycin, Ery
Apramycin, Am
bla
cat
hyg
aacaph
aadA
str
tsr
ermE
aac(3)IV
100
25(无水乙醇配)
50
25
50
50
25(DMSO配)
100
50
R
10
10
2?
50
10
5
100
10
R
25
50
50
25
10
50
R
50
2.5
50
50-100
25
50
50
50
25
不敏感
20
30-50
*– 表示无记录或不能使用,贮存液除特别说明外均用无菌水配制
*此表仅供参考!!!
*R表示不敏感
*Km 和Am有交叉抗性,所以同时具有这两种抗性基因时应适当提高抗生素的量,并作好对照。
*Hyg易见光分解,应用锡箔纸包好。
*有些抗生素需要在低盐的环境(如DNA培养基)下筛选效率较高,如Hyg, Km, Vio
 

LB(Luria-Bertani)培养基

胰蛋白胨 10g,
酵母抽提物 5g,
NaCl 5g,葡萄糖 1g,
蒸馏水加至 1000ml,
pH7.3左右(灭菌后第一次用时还要调一次)
 

LA

LB中加入终浓度为1.5-2%的琼脂粉(不同的琼脂加的量不同,如青岛琼脂大概需1.5%,而华美的需要2%)。
*做蓝白斑筛选时不加葡萄糖

基本培养基(MM)

溶液:L-天冬酰胺 0.5g,
K2HPO4  0.5g,
MgSO4·7H2O  0.2g,
FeSO4·7H2O  0.01g,
蒸馏水至 1000ml
将每250ml溶液分装到装有2.5g琼脂的500ml三角瓶中,灭菌,使用时每瓶加入50%葡萄糖(8磅灭菌)5ml,调pH7.0。
配置MM的琼脂有lab agar、Ice agar(IA)
 

R5(1L)链霉菌原生质体转化时用

   蔗糖                                     103g
   K2SO4                                                    0.25g
   MgCl2·6H2O                             10.12g
   葡萄糖                                   10g
   Difco酪蛋白氨基酸                        0.1g
   微量元素溶液                             2ml
   Oxoid酵母提取物                          5g
   TES                                      5.73g
   加蒸馏水至                               1000ml
称取5.5g Difco琼脂放入500ml三角瓶中,倒入250ml上述溶液,然后塞上塞子后8磅灭菌(114度15分种)。使用时,将培养基融化,每瓶中加入:
   KH2PO4(0.5%)                              2.5ml
   CaCl2·2H2O(5M)                           1ml
   L-脯氨酸(20%)                             3.75ml
   NaOH(1M)调pH至7.3                     
对营养缺陷型菌株加入适当的营养因子(请参考《手册》)
 

YEME(酵母膏-麦芽膏培养基) 1L(液体培养链霉菌)

   Oxoid酵母提取物                           3g
   Oxoid蛋白胨Tryptone                        5g
   麦芽提取物(BD公司原Difco公司218630)    3g
   葡萄糖                                     10g
   蔗糖 *                                    340g
   蒸馏水                                   至1000ml
高压灭菌后加入:(8磅灭菌,113-114゜C,15min,自动灭菌锅一次不能灭过多东西,否则会灭不彻底。)
   MgCl2·6H2O(2.5M)                          2ml/L
制备原生质体时,还要加入:
   甘氨酸(20%)  *                          25ml/L
*     蔗糖的主要作用是维持链霉菌生长时的渗透压。
*     甘氨酸被认为能干扰链霉菌细胞壁的形成,使菌丝体片段更短,利于溶菌,有利于外源DNA的导入。
 

TSBY (1L)(液体培养链霉菌)

   Oxoid胰胨豆汤粉(TSB)                   30g
   蔗糖*                                    340g
   Oxoid酵母抽提物                            5g
   蒸馏水                                    至1000ml
*不同菌株培养需要不同浓度的蔗糖,蔗糖的主要作用是维持链霉菌生长时的渗透压。
 

MS培养基

将黄豆饼粉加蒸馏水煮2到3小时,用纱布过滤得到滤液,将每250ml滤液分装到装有5g琼脂,5g 甘露醇的500ml三角瓶中,10磅灭菌,使用时调pH7.2-7.3。
 

2CMY培养基(用于井岗的接合转移)

可溶性淀粉                 10g    
胰蛋白胨                   2g
NaCl                       1g
(NH4 )2SO4                           2g
K2 HPO4                    1g
CaCO3                      2g
无机盐溶液*               1 ml
琼脂                      20g
蒸镏水                   1000 ml
PH7.2
 
无机盐溶液(每升)
FeSO4 .7H2 O    1g
MgCl.6 H2 O    1g
ZnSO4. 7H2 O    1g
 

YMS培养基阿维,井岗产孢

酵母抽提物                 4g
可溶性淀粉                 4g
麦芽糖                    10g
CoCl. .6 H2 O               5mg
琼脂                      20g
蒸镏水                   1000 ml
PH7.2
 

YD培养基

酵母抽提物               4g
麦芽糖                   10g
葡萄糖                   4g
MgCl                    2g
CaCl                    1.5g
琼脂                    15g
蒸镏水                  1000 ml
PH7.2
 

生长因子补充物的使用浓度

     天蓝色链霉菌1258 、J1501等都是营养缺陷型菌株,培养这些菌株时一般需向培养基中补加营养因子,使用浓度如表
生长因子补充物的使用浓度表
 
化合物
储存液(mg/ml)1
终作用浓度(μg/ml)
组氨酸(Histidine)
10
50
其它氨基酸2
7.5
37
腺嘌呤,鸟嘌呤,
胸腺嘧啶,尿嘧啶
1.5
7.5
维生素
0.1
0.5
1.       储存液用无菌去离子水配置,8磅灭菌后4oC保存。
2.       对于半胱氨酸营养缺陷型菌株,补充光氨酸。

 

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