银河澳门官网入口,银河集团网址登录



银河澳门官网入口,银河集团网址登录

中文版  |   English  |   加入收藏  |   客服热线:400-0532-596
微生物技术资料
文章检索
  首页 > 微生物知识->病毒基本知识和检测方法->病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增

病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增



录入时间:2009-8-17 11:48:47 来源:青岛海博

  一旦重组病毒已被纯化和鉴定,即可在QBI-293A细胞中进行大量扩增。本手册提供了递增培养规模和腺病毒感染周期的基本方法,按这一方法最终得到的病毒量约为3×1011~3×1012。由于一个细胞中所含的病毒颗粒为1000~10000,因此1L培养细胞可得到约5×1012病毒颗粒。如果要把病毒用氯化铯梯度离心纯化,则必须至少3×108的细胞,这样才能正确分辨出病毒带。对于蛋白表达,则根据需要可在任何一步扩增步骤中停止,离心沉淀细胞后按照适当的操作方法进行蛋白抽提(根据蛋白类型的不同抽提上清或细胞沉淀)。为优化时间进程,每个感染周期必须与下一次细胞扩增培养同步。如果由于各种原因不能同步,则必须将病毒冻存,直至下一次细胞培养开始后再融化病毒。注意每次扩增都将会剩下一些病毒,这些病毒先不必丢弃,以便下一步扩增失败时备用。每次扩增最好都用最低代的病毒颗粒,这样产生突变型病毒的可能性会大大降低。
 
操作步骤:
1. 在100mm培养皿或75cm2培养瓶中加入10ml DMEM5%培养5×106 QBI-293A细胞。
2. 取0.5ul首次扩增的病毒保存液,加入DMEM5%至1ml,混匀,这样稀释应得到的MOI值约为5。 
3. 移去培养液,小心加入病毒混合液,切勿破坏细胞单层,十字形慢慢晃动3次,37℃ CO2孵箱中培养90分钟。 
4. 加入9ml DMEM5%。
5. 再培养72小时,这时在10ml溶液中大约有5×109~5×1010个病毒颗粒,进行MOI测定以估计病毒颗粒(5.3)。   
如果此时得到的病毒量已足够,可立即进行病毒滴度测定(5.8)。收集细胞,600×g离心5分钟沉淀细胞,去上清后加入最小体积(一般为原始体积的1/10即1ml)病毒保存溶液重悬细胞。-20℃/37℃冻融3次,台式离心机上以最大速率离心去除细胞碎片,收集上清,然后按5.8进行病毒滴定。
 
6. -20℃/37℃冻融3次。
7. 转入15ml无菌离心管中,台式离心机上以最大速率离心10分钟,收集上清冻存于-20℃或-80℃。
8. 3个175cm2培养瓶中各加入107 QBI-293A细胞进行培养。
9. 将3ml细胞裂解液上清加入12ml DMEM5%中,混匀。移去细胞培养液,每瓶小心加入5ml混合液,十字形慢慢晃动混匀3次,37℃CO2孵箱中培
养90分钟。此时MOI值约为25。
10. 加入DMEM5%至30ml。
11. 再培养48~72小时。此时10ml培养液病毒量约为3×1010~3×1011。若需要,进行MOI测定(5.3)以估计病毒滴度。此时如果病毒量已足够,则可立即进入病毒滴定步骤(5.8)。600×g离心5分钟收集细胞,弃上清,加入1/10原始体积的溶液重悬细胞。-20℃/37℃冻融3次,台式离心机上以最大速率沉淀细胞碎片,收集上清,按5.8章中所述进行病毒滴定。
12. 移入50ml离心管中,台式离心机上最大速率离心10分钟,取出上清保存。 S1 3ZdaHiJ 
13. 30瓶175 cm2培养瓶中每瓶各加入107 QBI-293A细胞。
14. 将45ml细胞裂解液上清加入105ml DMEM5%混匀,从培养瓶中移去培养液,加入5ml混合液感染细胞,十字形缓慢晃动3次混匀,37℃培养90分钟。此时MOI值约为25。
15. 加入DMEM5%至30ml/瓶。
16. 再培养48-72小时,此时约有3×1011~3×1012个病毒。若需要,进行MOI测定估计病毒滴度。如果要收集病毒颗粒,先收集被感染细胞,然后重悬在5ml DMEM5%中。-20℃/37℃冻融3次,离心沉淀细胞碎片。此时5ml DMEM5%中3×1011~3×1012个病毒颗粒,浓度为6×1010~6×1011vp/ml。然后按5.8章中所述滴定病毒储存液,或者用标准的氯化铯密度梯度离心法纯化病毒。在109细胞中扩增病毒可获得大量病毒保存液,而在1010细胞中扩增则有一定技术性。切勿将扩增后的病毒保存液再用来感染细胞,因这会大大增加RCA产生量。有时不得不使用纯化空斑以最大可能降低RCA产量。如果已没有纯化的空斑,那么就不得不重新空斑纯化重组病毒,鉴定克隆后再进行扩增。如果需要大于扩增4轮后的病毒量,注意请用早期的病毒作为扩增源。比如,用第2代病毒产生第3代病毒。如果没有第2代病毒,那么必须用第1代病毒来产生新的第2代病毒。按这个原则进行扩增可使RCA水平尽可能低。如果用于表达蛋白,则可以收集细胞后根据蛋白特点选择适当方法抽提蛋白。细胞沉淀中一般可提取1-5mg蛋白,建议在小规模扩增后先测定感染后抽提蛋白的最佳时间,然后再大量扩增蛋白。 
表5:腺病毒扩增
         第一代 第二代 第三代 第四代 21D c}GlEH 
每瓶细胞数 1×105 5×106 1×107 1×107
培养瓶大小 
(cm2)   75 175 175
培养瓶数 24孔板1孔 1 3 30   
感染来源 稀释的空斑 首次扩增后的病毒保存液 第二代病毒 第三代病毒
每瓶接种量 0.1 mL 0.5 mL或 n d 
2.5×107   1 mL 1.5 mL 
总培养体积 1 mL 10 mL 90 mL 900 mL 
MOI 0.01 5 25 25 A
滴度(VP/mL) 1×108~9 5×108~9 3.3×108~9 3.3×108~9 
总病毒量 1×108~9 5×109~10 3×1010~11 3×1011~12

 

上一篇:重组腺病毒的筛选和纯化

下一篇:两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒

首页 | 关于我们 | 网上商城 | 在线客服 | shchuhu.com
业务联系电话
   400-0532-596 0532-66087773
   0532-66087762 0532-81935169
邮箱:qdhbywg@vip.126.com
地址:青岛市城阳区锦汇路1号A2栋
产品技术咨询
  工作日(周一至周六8:00-18:00):
  18562658263 13176865511
  其它时段:13105190021
投诉与建议:13105190021 13006536294