抑菌剂在开放组培中的使用及效果研究一
录入时间:2009-7-13 14:28:16
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摘要：采用平板生长抑制法、菌丝生长速率法和袍子萌发试验法检测了几种抑菌剂对植物组织培养中常见细菌和真菌的抑菌作用．结果表明．Yl 一1 抑菌作用具广谱性，其对微球菌、葡萄球菌最低抑菌浓度均为62.5mg/L；对棕曲霉、黑青霉菌丝生长最低抑菌浓度分别是15.625 、7.812 5mg/L ；对棕曲霉、黑青霉孢子萌发最低抑菌浓度均为3.906 25 、62.5 mg / L 的Yl 一1 对马铃薯试管苗生根、分化及生长无抑制作用，且在开放组培中未发生污染，可用作开放性植物组织培养中的抑菌剂．
关键词：抑菌剂；细菌；真菌；植物组织培养
利用植物组织培养技术进行无性繁殖的方法已取得了很大的进展，与传统的植物繁育方法相比，这方法具有快速高效，不受季节限制，有时还结合“脱毒”技术取得防止带病退化、增强生活力及较好地保持种性的效果．然而，在植物组织培养过程中，常发生较高频率的微生物污染，阻碍了组织培养快繁技术的应用．因此，预防和抑制试管苗中微生物，对提高试管苗的快繁率，具有十分重要的理论意义和应用价值．目前，国内有关抑制试管苗污染微生物的研究不够广泛、深人，不能全面解决问题．本研究从5 种农药中筛选出2 种作为抑菌剂，研制了一个配方，并研究了农药对植物生长、分化、生根的影响．此外，本实验对开放组培的可能性进行了初步研究，期望在植物组织培养方面取得一定的突破．
1 材料与方法1.1 供试材料
1.1.1 供试药剂 50 ％多菌灵可湿性粉剂、70 ％代森猛锌可湿性粉剂、Yl 一1 、57.6 ％冠菌清干粒剂、50 ％扑海因悬浮剂、75 ％百菌清可湿性粉剂．
1.1.2 供试菌种 微球菌（Micrococcus）、葡萄球菌（Staphylococcus）、棕曲霉、黑曲霉、黑青霉、杜氏青霉都是从被污染的培养植物上分离纯化获得．
1.1.3 培养基 YEB 培养基；PDA 培养基．
1.2 试验方法
1.2.1 污染细菌鉴定革兰氏染色法初步鉴定细菌．
1.2.2 抑菌强度测定无菌水稀释药剂成1 000 mg / L ．细菌取0.2 mL 对数期菌悬液（真菌取0.2 mL 孢子菌悬液（106 个／mL ) ）与20 mL YEB （真菌PDA ）培养基混匀倒平板．凝固后每一平板置2 个牛津杯（直径8mm ) ，一杯加O.2mL 药剂，另一杯以无菌水作对照，置于28 ℃ 温箱培养，葡萄球菌培养24h 、微球菌和真菌培养48h 后，取出测抑菌圈直径．
1.2.3 细菌最低抑菌浓度测定 用无菌水稀释药剂成2 000 mg / L 原液，然后按1 : 2 , 1 : 4 , l : 8 ．二稀释至15.625 mg / L ，余下均同1.2.2.
1.2.4 菌丝生长抑制实验 用无菌水配制成106 个／mL 孢子悬浮液，分别取0.2 mL 孢子悬浮液与20 mLPDA 培养基混匀倒平板，28 ℃ 温箱遮光培养48h 后备用．用无菌水稀释药剂成2 000 mg / L 原液，然后配制成1 000 , 500 , 250……0.9765625mg /L 的含药培养基，对照为不加药的培养基．用打孔器（直径7 mm ）从备用平板中打取菌饼，菌丝面朝下接种于含药培养基中央，每平板加一个菌饼，3 次重复，28 ℃ 温箱遮光培养，每2d 取出测量菌落直径．
生长抑制率（% ）={（对照菌落直径一菌饼直径）一（处理菌落直径一菌饼直径）/ （对照菌落直径一菌饼直径）} *100 %
1.2.5 袍子萌发抑制试验 将孢子接种于液体PDA 中，于28 ℃ 、130 rad / min 摇床上培养24h ，双层纱布过滤后用无菌水调制成104 个／mL 备用．用无菌水稀释药剂成2 000 mg / L 的原液，然后配制成1000 、250、62.5 ……0.9765625mg / L 的含药培养基．分别取2mL 孢子悬浮液与不同浓度的含药培养基混匀，3 次重复，28 ℃ 培养，72h 后镜检计算孢子萌发抑制率.
孢子萌发抑制率（% ）={（对照萌发率一处理萌发率）／对照萌发率｝x100 %
1.2.6 对植物生长抑制试验与开放组培初探用无菌水配制药剂成2 000 mg / L 原液，4 000 rad / min 离心10min ，上清液用孔径20nm 的滤膜过滤备用．将滤好的原液与培养基混合配制成1000 、250 、62.5 mg / L 的含药培养基．取健壮的马铃薯试管苗剪成小段，接种于上述含药培养基，对照为不加药的培养基，每梯度6 瓶，每瓶10 株，其中3 瓶正常放置，3od 后观察马铃薯生长情况，另外3 瓶开口放置，20d 后观察马铃薯的污染情况．
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