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正粘病毒化学组成及其功能



录入时间:2009-7-9 13:38:00 来源:青岛海博

 正粘病毒化学组成及其功能
 
流感病毒由68%~70%的蛋白质、1%~2%的核糖核酸(RNA)、20%~25%脂质和5%~8%的糖组成。病毒蛋白质含有5种多肽,即血凝素、神经氨酸酶、基质蛋白、核蛋白和多聚酶。
(1) 正粘病毒基因组组成
〖HT5SS〗流感病毒的基因组是由8个分节段的单链、负股RNA组成,其中4、6号两个节段编码病毒囊膜糖蛋白,比较而言,丙型流感病毒仅编码单一表面糖蛋白,因而丙型流感病毒的基因组由7个RNA节段组成。流感病毒基因组片段具有共同的特点:所有的RNA节段均具有相同的5’端,它由13个核苷酸所组成;3’端由12个高度保守的核苷酸组成,靠近3’端的第四个碱基,有些毒株为U,有的为C。在这些共同序列中,有部分序列可反向互补,这一点对病毒RNA的复制很重要;在每一节段靠近5’端15~21核苷酸处有一保守区,其序列为polyU。这一保守区在病毒mRNA合成时是产生polyA的信号。因为每一RNA节段的3’和5’端有部分序列互补,所以每个RNA节段呈锅柄环状。第1~6个节段各编码一个病毒蛋白,7、8节段则编码2个病毒蛋白,这样甲、乙型流感病毒具有10种蛋白多肽,推论丙型流感病毒具有9种蛋白多肽,可目前仅证实8种。核酸具体编码见表24-3。由于流感病毒的基因组分节段的结构特点,导致了基因组的易变性和具有很高的重组率。流感病毒RNA总分子量为59~63MD。甲、乙和丙型流感病毒基因组的大小和碱基组成不尽相同,AU∶AC的比率甲型为1:25;乙型为1:42;丙型为1:46。提纯的流感病毒RNA不具有感染性,需与一些具有多聚酶活性的蛋白结合在一起才具有感染性。
 (2) 正粘病毒核蛋白(NP)
流感病毒的核蛋白,分子量约60kDa,是单体磷酸化的多肽,是构成核衣壳的主要成分。核蛋白具有型特异性,根据其抗原性的不同,可将流感病毒分为甲、乙、丙三型,它是可用补体结合试验方法测定的型特异抗原,即可溶性抗原。它没有感染性,在病毒粒子内部卷曲成螺旋状结构,是病毒核酸外面的一种蛋白质,但它并不把核酸完全包被起来,因而核衣壳仍对核糖核酸酶敏感。核糖核酸被酶裂解后,核蛋白亚单位仍然存在,推测核蛋白自身形成一种内聚结构。核蛋白是一种多功能蛋白质,除了形成病毒的核衣壳外,在病毒基因组的转录和复制中也可能起作用。在确定病毒的宿主特异性方面也有作用,例如根据对许多流感病毒NP基因的研究,可将它们分为5个不同的组,所有的禽流感病毒分为两个组,马流感病毒分为两个组,猪流感病毒分在一个组。核蛋白的磷酸化取决于宿主细胞,与病毒感染的宿主谱有关。核蛋白分子至少具有3个独立的抗原位点,借助于单克隆抗体和多克隆抗体进行研究,发现所有被测毒株都有一个共同位点,针对这一位点的单抗可抑制病毒RNA分子的体外转录。针对核蛋白的单克隆抗体不能给动物提供被动保护,用提纯的NP免疫动物,也只能产生很微弱的抗感染能力,但NP是细胞毒性淋巴细胞识别的主要抗原。
 
(3) 正粘病毒基质蛋白(matrixproteins,MA)
基质蛋白是一种非糖基化蛋白,是由甲、乙型流感病毒的7RNA节段、丙型流感病毒的6RNA节段编码。非糖基化蛋白存在于囊膜蛋白的内侧,也称为内膜蛋白,是病毒粒子的主要蛋白。片段7或6有两个读码框架,可转录出两个mRNA,分别翻译出一种蛋白质。因此流感病毒的基质蛋白有两种,即M1和M2。M1由252个氨基酸残基组成,分子量约26kDa,它是病毒的主要结构蛋白,占流感病毒蛋白总量的40%。这种蛋白也具有型特异性,其抗原性的差异是流感病毒分型的依据之一。M1位于病毒囊膜的类脂双层内侧、核衣壳的外侧,是维持病毒形态的结构蛋白。另外M1还可在感染细胞的细胞核、细胞质和细胞膜上发现。研究表明,M1的氨基端含有一亲水区,羧基端与病毒的转录酶之间相互作用。流感病毒的M1具有多种功能,除维持病毒粒子的形态外,还能调节病毒转录酶的活性,另外在子代病毒粒子装配过程中也起重要作用。据报道,M1单克隆抗体不能给动物提供被动保护。M2由97个氨基酸残基组成,分子量大约为15kDa,由片段7转录的第二个小mRNA翻译出。M2也是一种跨膜蛋白,主要以四聚体形式存在于感染细胞的细胞膜上,另外也是病毒囊膜上的蛋白组分之一。每个病毒粒子大约含有14~68个M2分子。流感病毒M2的主要作用是在HA合成过程中作为质子通道控制高尔基体内的pH值;在病毒脱壳时酸化病毒粒子的内部环境;另外在病毒装配过程中也起作用。流感病毒M2的氨基酸序列很保守,在所检测的毒株中,其同源性高达90%。这种蛋白在感染细胞的细胞膜上与I类糖蛋白相似,即氨基端在细胞外,羧基端在细胞内。细胞外部分为18~23个氨基酸,19个氨基酸残基组成的疏水区插入细胞膜内,羧基端的54个氨基酸位于细胞质内。氨基端的10个氨基酸非常保守,在所测的禽流感和人流感病毒中,其序列几乎完全相同。研究表明,针对M2氨基端的单克隆抗体可抑制病毒蚀斑的增大,其作用方式与抗神经氨酸酶抗体的作用方式相同。用这种单抗筛选突变株时,不仅引起M2的突变,还能引起M1的突变。
(4) 正粘病毒聚合酶(polymerase)
流感病毒的聚合酶由三种成分组成,它们是PB1、PB2、PA。这三种蛋白质是病毒粒子中分子量最大的蛋白质,分别为PB196kDa,PB287kDa,PA85kDa。这三种蛋白质在氨基酸序列上有一共同特点,都含有一特异的亲核序列区,其作用是使这几种蛋白质在胞浆合成后能顺利进入细胞核。所以在感染细胞的细胞核内都可发现这三种蛋白成分。流感病毒聚合酶复合体在病毒粒子中所处的位置目前已经清楚。三种蛋白质位于病毒基因组的3’末端,免疫电镜技术已直接观察到这一复合体位于每一个核壳体的一端。聚合酶复合体的三种成分分别由不同的基因组片段编码。PB1由片段2编码,共757个氨基酸残基。其功能是在病毒mRNA合成起始后使之逐渐延长;在模板RNA(cRNA)和病毒RNA(vRNA)的合成过程中也靠PB1的作用使合成链增长。PB2由片段1编码,大约759个氨基酸残基。其作用是在病毒mRNA转录的起始阶段,识别并结合在5’端I型帽子结构。另外它还具有限制性内切酶活性,参与宿主mRNA帽子结构的切割。PB2在病毒cRNA和vRNA合成过程中的作用还不清楚,因为这些过程不需要宿主mRNA的帽子结构做引物。PA由片段3编码,由716个氨基酸残基组成。在病毒RNA转录和复制过程中,PA与PB1和PB2在一起随链的延长而移动,因此推测PA与PB1和PB2共同构成RNA聚合酶复合体。但PA在病毒RNA合成过程中的作用还不清楚,有人认为可能是一种蛋白激酶或解旋蛋白。
(5) 正粘病毒非结构蛋白(nostructuralproteins,NP)
甲、乙型流感病毒的非结构蛋白由片段8编码,丙型流感病毒由片段7编码。片段8或7也有两个读码框架,可编码两种蛋白质即NS1和NS2,两者的分子量分别为25kDa和12kDa。主要在胞浆内,在病毒粒子内不存在这两种蛋白成分。流感病毒非结构蛋白的功能还没有彻底搞清,可能在病毒复制过程中起一定作用,NS2还可能有调节非结构蛋白合成的作用。在细胞感染流感病毒的早期就可发现细胞核内有大量的NS1聚集,另外还可在细胞浆内发现。NS2合成较晚,主要存在于细胞胞浆,也可在细胞核内发现。序列分析表明,NS1和NS2有70个氨基酸的重叠,并且在氨基端有9个氨基酸是相同的。NS1蛋白含有两个核定位信号区,其中34~38位氨基酸残基处的信号区非常保守,在所有甲型流感病毒中都相同。第二个信号区在203~237位氨基酸残基处,在大多数甲型流感病毒中都有这一序列。野外分离的禽流感病毒的某些毒株,NS1蛋白的羧基端有氨基酸缺失现象。不同亚型毒株的NS在带电性和磷酸化方面有很大差异。用多克隆抗血清对NS1的抗原性进行研究,结果发现,不同亚型毒株之间存在明显的交叉反应。从人、猪、马分离的甲型流感病毒,其NS1的抗原性非常相似,一般方法难以区分,而禽流感病毒株的NS1其抗原性有变异。
(6) 正粘病毒脂质层
由内、外两层构成,紧靠于内膜蛋白之外。脂质占病毒粒子总重量的20%~25%,使病毒对乙醚和其它脂溶剂敏感。HA和NA亚单位的疏水性末端即植入于这个脂质层内。流感病毒的脂质与副粘病毒相似,主要来自宿主细胞,由磷脂、胆固醇和三甘油脂组成,其中磷脂和胆固醇占95%以上。
(7) 正粘病毒宿主抗原
在不同种动物细胞中生长的流感病毒粒子,带有各该动物细胞的宿主抗原。例如,在鸡胚细胞中培养的病毒,给家兔进行免疫注射,不仅使其产生抗病毒抗体,而且还能产生抗鸡胚细胞的抗体。宿主抗原占病毒总重量的5%,分子量为15kDa,大部分是糖。宿主抗原连结于病毒表面蛋白上,可能是HA和NA的糖蛋白中的糖组分。抗宿主抗体主要针对宿主细胞的糖。
(8) 正粘病毒血凝素
血凝素(HA)是流感病毒的主要表面糖蛋白,具有凝集多种动物红细胞的性质,借助HA对细胞受体的作用,使病毒附着于细胞,在穿膜过程中起关键作用。HA具有诱生中和抗体的能力,产生免疫保护作用。HA可以直接通过血凝反应检测,其抗体可用血凝抑制、中和试验、补反和ELISA方法来检测。流感病毒的HA呈三角细长的棒状构造。HA为75kDa的糖蛋白,可水解成两个独立的肽链,两个多肽由二硫键连接在一起。HA水解成HA1和HA2是感染的先决条件。HA的变异性很强,是病毒发生抗原变异的主要原因。HA由甲、乙型流感病毒RNA片段4编码,是典型的I型糖蛋白。它含有4个结构域:信号肽(前导序列)、胞浆域、跨膜域和胞外域。免疫学和生物化学方法研究证明,HA在细胞内质网合成。合成后由内质网运送到高尔基复合体,最后到达细胞膜,嵌入胞膜的脂质双层,在病毒出芽释放时被带到病毒囊膜上。HA在运送过程中经过不断的修饰,如将N-葡萄糖苷寡糖加到天门冬酰胺残基上,有些寡糖加上去后还经过进一步修饰。修饰的位置随毒株不同而有区别。这样形成的单体HA分布在内质网膜上,在向高尔基体运送过程中,由二硫键连接并折叠成一定的形状,随后形成三聚体,由高尔基体运送到细胞膜。HA产生后到其发挥作用时,还经过几个切割加工过程,包括N端信号肽的切除及HA1和HA2的产生。N端的信号肽约由16个氨基酸残基组成,其作用是识别内质网膜。HA合成后由信号肽酶将这一短肽切除,因此成熟的HA不含信号肽。另一个加工过程是将HA切割成两条多肽链,产生HA1和HA2。切割时去掉一个或多个氨基酸残基,这与宿主细胞及毒株的毒力有关。HA1和HA2的分子量分别为36kDa和27kDa,两条肽链被一个二硫键连在一起,再加上分子内的一些二硫键及其它非共价键的相互作用,使HA形成一定的立体结构。HA的一级结构〓根据对不同亚型毒株HA的氨基酸序列测定及根据其片段4的核苷酸序列推测,HA大约由562~566个氨基酸残基组成。在HA的氨基端有一由16个疏水氨基酸组成的信号肽,在加工过程中被信号肽酶切掉。紧接信号肽的328个氨基酸残基是HA1部分,羧基端的221个氨基酸残基构成HA2。在HA1和HA2之间有一精氨酸残基,在加工过程中被切掉。经过切割后产生的HA1和HA2由一个二硫键和许多非共价键连在一起,两条肽链之间的二硫键在HA1的14位和HA2137位的半胱氨酸之间形成。另外在HA1和HA2分子内还有其它的二硫键。HA2的羧基端(185~211氨基酸区域)主要由疏水氨基酸残基组成,HA靠这一部分插入病毒囊膜的脂质双层。最末端的10个氨基酸残基多数是亲水性的,因此可伸出脂质双层进入病毒粒子内。HA是一种糖蛋白,每一个HA单体分子上带有7个寡糖链,其中6个在HA1,1个在HA2。这些寡糖链都通过N-葡萄糖苷键与天门冬氨酸残基相连。HA中寡糖的总量约占20%,主要由氨基葡萄糖组成,一些甘露糖形成枝状结构,此外还有少量的岩藻糖,其最外端是半乳糖。在其它病毒糖蛋白的寡糖末端常带有唾液酸(N-乙酰神经氨酸),但流感病毒没有,这是由于病毒粒子含有神经氨酸酶的缘故。   目前对大多数亚型的HA已经测序,通过序列比较发现半胱氨酸残基在所有亚型的序列中都很保守。这表明它们从一个共同的“祖先”进化而来,并且表明它们的结构都相似。通过部分氨基酸序列的比较发现,H1和H3亚型差别最大,仅25%的同源性;其它亚型之间的同源性较高,H2与H5亚型HA之间序列的同源性最高,为80%;相同亚型的不同毒株之间,HA序列的同源性在90%以上。  HA的三维结构〓流感病毒囊膜表面的纤突是三个HA聚合在一起形成的三聚体。用去污剂将病毒粒子裂解后可分离到完整的HA纤突。当把去污剂除去后,HA分子靠其疏水端聚集在一起形成玫瑰花样。用蛋白水解酶(如菠萝蛋白酶)消化某些毒株,可分离到不完整的HA分子。HA纤突由三个HA单体分子组成,单体可分为两部分,一部分是呈球状的头部,含有受体结合位点和抗原决定簇;另一部分为柄,与囊膜相连,长约7.6nm。三聚体的总长为135nm。用X线衍射技术对HA研究的结果表明,HA1的氨基端和HA2的羧基端位于分子的末端,并且靠近囊膜。球状头部由HA1组成,茎部由HA2和部分HA1组成。在HA头部和茎部各单体之间都有局部接触,这样使之形成的三聚体更加稳固。
(9)神经氨酸酶(NA)
神经氨酸酶是流感病毒粒子表面的另一重要抗原。NA可水解细胞表面受体特异性糖蛋白末端的N-乙酰基神经氨酸。病毒在细胞表面成熟时,NA可以移去细胞膜出芽点上的神经氨酸,有利于病毒粒子的成熟和释放。它具有免疫原性,能诱发相应的抗体。NA抗体可以抑制酶活性,并具有免疫保护作用。NA亚单位为四聚体,呈哑铃状,外端呈钉帽状,大小为9×5nm,内端呈结节状,直径4nm,像树根一样植入于脂质层内,两端由一长10nm的杆相连。NA亚单位的分子量为200kDa,它是由二个相同的并由二硫键连接的55kDa糖蛋白的二聚物,即由4个单体NA所组成,见图24-4。NA的酶活性可以进行定量测定。HA和NA是甲、乙型流感病毒的两种糖蛋白,而丙型流感则有一种糖蛋白,即血凝素—酯酶(hemagglutinin-esterase,HE),具有HA的特性,又具有NA的酯酶活性。但丙型流感不具有NA活性。用去污剂、脂溶剂或蛋白水解酶(如胰蛋白酶、枯草菌素、链霉蛋白酶)处理,可使NA纤突从病毒粒子上释放下来。通过电子显微镜观察,发现释放的NA纤突呈蘑菇状。除掉去污剂后,这些纤突可通过疏水的茎部聚集在一起呈玫瑰花形。链霉蛋白酶处理释放的纤突,具有完整的酶活性和抗原性。病毒囊膜上的NA纤突是NA单体形成的四聚体,它包括一个蘑菇状的头部和一个细茎。
NA是一种糖蛋白,其蛋白部分由片段6编码。目前对绝大多数亚型毒株的片段6序列已经清楚,并能从基因序列推测出其氨基酸序列。通过对去污剂处理后释放的NA进行部分氨基酸序列分析,发现与基因推测的序列很一致。NA蛋白质序列的特点是翻译后不经过切割;信号肽不被除去;翻译起始用的蛋氨酸仍然存在;羧基端也不曾经过加工。NA与HA不同,它属于II类糖蛋白,即氨基端在囊膜内而羧基端在囊膜外,与HA正好相反。NA的一级结构包括4个区域,分别为氨基端胞浆尾、非极性跨膜区、茎部和头部序列。NA的氨基端胞浆尾包括6个氨基酸残基。根据目前所检测的不同亚型的NA序列,发现氨基端胞浆尾非常保守,在所有的甲型流感病毒中都相同。这表明这一序列可能具有重要功能,但其真正功能目前还不清楚。NA的非极性跨膜区包括氨基端7到35位的氨基酸残基,其中前6个比较保守,其余23~25个氨基酸变异较大。用去污剂和链霉蛋白酶处理提取NA后进行序列分析,证明非极性跨膜区的作用是将NA固定于脂质双层;NA合成后在内质网的运输过程中,这一序列起信号肽的作用。非极性跨膜区的长度在不同的亚型之间有差别。NA的茎部长度及序列在不同的毒株也有很大的差异。茎部的主要功能是帮助形成NA四聚体,当四聚体形成后,用链霉蛋白酶可将其茎部切下,而剩余的四聚体头部仍可保持正常的结构,并且抗原和酶活性都不受影响。茎部是否还有其它功能,目前还不清楚。NA的头部序列在不同亚型的毒株有较高的同源性(46%),这一点与茎部和非极性跨膜区不同。用链霉蛋白酶处理将NA茎部和跨膜区除去,获得NA的四聚体头部,通过X线晶体衍射技术研究表明,四聚体头部大小为100×100×60nm,由4个相同的单体构成。每一个单体由6个β折叠组成,每个折叠又由4条反平行排列的肽链组成。每个折叠的立体构型都相同,呈螺旋桨叶片状,按逆时针方向排列。连接β-链的茎环结构在不同亚型之间的差异,其氨基酸的变化是造成NA酶活性和抗原性变异的原因。NA酶活性的催化中心位于头部顶端,呈凹隐状,每个NA单体都有一个,所以HA纤突具有4个催化中心。研究表明,每个NA纤突有4个抗原位点,每个位点又含有多个抗原决定簇。

 

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