银河澳门官网入口,银河集团网址登录

银河澳门官网入口,银河集团网址登录

中文版  |   English  |   加入收藏  |   客服热线:400-0532-596
微生物技术资料
文章检索

病毒基因探针的制备



录入时间:2009-6-29 9:26:46 来源:青岛海博

病毒基因探针的制备
 选择病毒基因序列作为探针时,首先要考虑所选定的探针是否具有高度特异性,换句话说, 作为探针的核酸片段必须含有病毒独特的核酸序列;其次应考虑探针来源是否方便,探针通 常来源于重组质粒中已克隆的病毒DNA片段,这样易于大量制备。一般来说,探针的大小在1~ 3Kb左右,如小于05Kb,可能难以大量制备,而且标记率不高;反之,片段过大(大于3Kb),则容 易出现非特异杂交。  (一) 病毒基因探针的种类 根椐来源及 性质,病毒基因探针可分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针和化学合成的寡聚核苷酸探 针等几类。试验者可根据需要和实验条件来选择使用这些探针。 1、基因组DNA探 针 对于双链DNA病毒,可用限制性内切酶切割其基因组DNA,克隆其中一个片段作为 探针材料。这一片段应该最具有该病毒的特点,代表该病毒最特异的基因序列。应用这种特 异探针所取得的杂交结果是最真实可靠的。对于单链DNA病毒,其基因组DNA不能被限制性内切酶切割,所以难以克隆特异片段。制备这类病毒的探针时,一般首先使用DNA聚合酶,制备其双链DNA,或者提取感染细胞中的复制型双链DNA,用适当内切酶切割后,克隆特异片段制备探针。 2、cDNA探针 制备单链或双链RNA病毒的探针时,一般先对病毒RNA进行反转录,合成该病毒的cDNA ,然后克隆特异cDNA片段作为探针材料。  3、RNA探针 应用RNA探针进行分子杂交是较为理想的。因为:①RNA/RNA 或RNA/DNA杂交体比 DNA/DNA杂交体更稳定,杂交反应可在更严格的条件下进行,因而杂交的特异性更高,结果更可靠;②RNA探针为单链,不存在互补双链的竞争结合,其与待测 核酸的杂交效率更高;③杂交后,可用RNase将未杂交的探针RNA消化掉,从而使本底降低。 RNA探针大多是通过基因组DNA或cDNA克隆经体外转录而获得的。  4、寡聚核苷酸探针 根椐病毒的特异序列,于DNA合成仪上化学合成一段单 链寡聚核苷酸,即可作为探针使用。其优点是容易制备,可根椐需要随意合成任何序列 ,在合成时就可以加入带有标记物的某一种dNTP,因此片段合成后勿需另外标记,纯化后即可 直接进行杂交。这类探针较短,长度一般不超过50nt,所以它所带的标记物相对较少,其灵敏 度也较低。  (二) 病毒基因探针的标记因标记物的不同,基 因探针的标记方法可分为放射性标记法和非放射性标记法。无论是DNA探针还是RNA探针,均可用这两种方法标记。根椐标记的部位,放射性标记可分为核酸片段内标记和末端标记。分 述如下: 1、DNA探针放射性标记法用于诊断的杂交实验,通常使用片段 内标记法制备的探针。末端标记法制备的探针,由于是由均一片段组成的,所以通常用作S1 核酸酶作图和DNA测序。在此主要介绍片段内标记法,它包括:(1)缺口翻译:其原理是用微量的DNase I在双链DNA上随机形成单链切口,然后利用大肠杆菌DNA聚合酶I的多种酶促活性将标记的dNTP掺入到新合成的DNA链中去。大肠杆菌DNA聚合酶I( E.coli  DNA polymerase I)具有两种活性:a.在缺口处从DNA5向3末端水解单链DN A;b.以一条DNA链为模板,从DNA5向3末端合成新的单链DNA片段。如果在DNA聚合酶处理 探针DNA片段的同时,加入α32P标记的dATP或dCTP和其它3种非标记碱基,32P 标记的碱基则可以掺入到新合成的DNA链中去,产生32P标记的放射性DNA片段。具体操 作方法如下:①用适当的内切酶从重组质粒中切下探针DNA片段,经普通琼脂糖电泳分离后 回收探针该片段;②取05~1μg探针DNA片段,加入25μl 10倍缺口翻译缓冲液(05 m o l/L Tris•HCl, 01mol/L MgSO4,1 mmol/L DTT,500μg/ml牛血清白蛋白组份V,pH75 ), 未标记dCTP、dGTP、dTTP各20nmol/L、50~100μCi α32PdATP,加水至25μl; ③用缺口翻译缓冲液加50%甘油,将胰DNase I稀释至10ng/ml,置-20℃冰箱备用;④ 加入25μl稀释的DNase I,混合,室温作用1分钟,使DNase I在DNA双链上水解出单链“缺口 ”;⑤加入25单位大肠杆菌DNA聚合酶I,混合;⑥置1 6℃水浴1小时;⑦加入1μl 05 mol/L EDTA终止反应;⑧标记探针直接可用于杂交检测。也可将标记探针通过Sephadex G25或50层析柱,分离纯化标记探针,去除游离的α32PdATP。缺口翻译标记的探针为单链DNA片段。应特别注意这种探针是不同分子量单链DNA的混合物。标记反应中,DNase I的浓度一定要适当,过高的浓度产生过多的缺口,从而使探针长度 过短,影响杂交效率;过低的浓度可因缺口产生过少而使标记效率下降。缺口翻译制备的探针可用于原位杂交、Southern和Northern 打点杂交,但不能用于S1核酸酶作图。它的 优点是可以对同一张硝酸纤维膜进行不同探针的多次杂交。我们曾用同一张膜进行过6次不 同探针的杂交。每次杂交后只需将膜放入2倍SSC煮沸两次,每次十分钟,即可基本消除杂交 的探针,而不影响吸附在膜上的病毒DNA片段。这一优点特别适用于分子量相似的病毒DNA片 段的检测。(2)随机引物法(random priming):在待标记的探针DNA变性后加入随机引物( 常用化学合成的六核苷酸寡聚物),在随机引物的引导下和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段的催 化下合成探针链。在合成过程中,加入放射性或非放射性标记的dNTP进行标记。标记方法如 下:①取一微量离心管,依次加入下列试剂: 5倍标记缓冲液  10μl dATP,dTTP,dGTP混合物 各20μmol/L 变性的待标记DNA模板 25ng  1mg/ml牛血清白蛋白 2μl  α32PdCTP 50μCi DNA聚合酶Ⅰ 大 片段 5单位 加灭菌去离子水至50μl ②混匀,离心,室温反应至少1小时 。为了提高标记效率,可室温反应过夜;③100℃煮沸2分钟终止反应,置冰浴,加入ED TA至20mmol/L终浓度;④标记的探针无需进一步纯化或乙醇沉淀,可直接用于杂交反应 。 5倍标记缓冲液: 250mmol/L Tris•HCl,pH8 025mmol/L MgCl210mmol/L 二巯基苏糖醇(DTT)1mol/L HEPES,pH6626A260单位/ml 随机六核苷酸引物 放射性同位素标记探针的缺点在于制备和 使用时操作者必需接触到一定剂量的放射性照射,如果防护不当,可能对健康造成一些影响 。另外,32P的半衰期为1429天,标记好的探针在冰箱中存放两个月后便不能使用。 近年来,人们开发出非放射性探针,以弥补上述缺点。根据我们的经验,非放射性DNA探针的 灵敏度与32P标记探针接近(但直接显色法比32P探针的灵敏度低10~100倍), 制备的探针可以反复使用,在-20℃冰箱中可以保存一年以上。该方法还可以用单链DNA为模板制备探针,因此适于制备单链和部分单链DNA病毒的探针。 2.DNA探针非放射性标记法 该方法的原理与上述的随机引物法一样。只是将同位素标记的dNTP 换成非同位素如地高辛标记的dUTP。用标记的探针与被检DNA或RNA杂交。加入碱性磷酸酶交联的抗地高辛抗体与杂交的探针结合,最后加入显色剂5溴4氯3吲哚磷酸盐(BCIP )和硝基兰四氮唑(NBT)直接在硝酸纤维素膜上显色。目前已有市售的药盒可供使用,操作 上并不复杂。以德国柏林格公司地高辛DNA标记试剂盒为例,其标记方法如下:①取10 ng~3μg待标记DNA,用酚、氯仿抽提,并用乙醇沉淀,溶于10μl 去离子水中;②95 ℃水浴5分钟,使模板DNA变性,立即置于冰浴5分钟;③加入2μl六核苷酸引物,2μl dNTP标记混合液(含地高辛dUTP),1μl Klenow片段,并加水至20μl;④37℃水浴 过夜(15小时);⑤加入2μl 02mol/L EDTA(pH80)终止反应;⑥加入25μl 4 mol/L LiCl和75μl无水乙醇,充分混合;⑦置-70℃30分钟或-20℃2小时沉淀探针DN A;⑧离心沉淀,洗涤,抽干;⑨将探针DNA溶于50μl TE缓冲液,即可用于杂交。 3、RNA探针标记法RNA探针的制备与标记一般通过体外转录进行。即将 探针DNA片段克隆到噬菌体启动子驱动的转录表达载体中,通过启动子特异的RNA聚合酶的催 化作用,在试管中以探针DNA的一条链为模板,转录RNA链,在转录过程中,如加入放射性或 非放射性标记的rNTP(通常用标记的rCTP,rGTP或rUTP),合成的RNA即可作为探针。转录载体中所使用的启动子是噬菌体的特异启动子,如SP6,T7,T3等,每一种启动子被各自 的RNA聚合酶识别。所以应用不同的启动子就可构建不同类型的转录载体。目前这些载体 均已商品化,可根据不同的实验进行挑选,但转录RNA的操作过程基本一样,只是注意根据 启动子类型来选择RNA聚合酶。如果在一个载体中有二种不同的启动子,这就构成了成对启动 子转录体系(如T7/SP6,SP6/T3,T7/T3等),外源DNA片段可插入这二种启动 子之间,其优点在于可根据实验需求选择转录正链还是负链。在转录时如果右端的启动子转 录mRNA,那么左端的启动子则转录与mRNA互补的反义RNA。转录质粒构建、模板制备及标准 转录过程如下:①将探针DNA片段插入转录载体的启动子,如SP6或T7下游,构建 转录质粒;②用适当的限制性内切酶在插入片段下游将转录质粒线性化;③酚/ 仿抽提,乙醇沉淀,重溶于无菌水中,浓度在02~10μg/μl之间;④室温下,在一无菌微量离心管中依次加入下列试剂: 5倍转录缓冲液 40μl 100mmol/L DTT 20μl RNasin(RNase抑制剂) 20单位 rATP,rGTP和rUTP 混 合物(各25mmol/L) 40μl 100μmol/L rCTP 24μl 线性化模板DNA  10 μl a32PrCTP(10mCi/ml) 50μl(50μCi) SP6或T7RNA聚合酶( 15~20u/μl) 10μl 加无菌水至总体积20μl ⑤混合后37~40℃温育6 0分 钟;⑥加无RNase的DNase,1u/μg DNA;⑦37℃温育15分钟,消化模板DNA;⑧酚/ 仿抽提,乙醇沉淀,RNA探针重悬于灭菌TE,置-70℃保存备用。 5倍转录缓 冲液:  200mmol/L Tris•HCl,pH7530mmol/L MgCl2 10mmol/L 亚精胺(spermidine)50mmol/L NaCl 由于转录的RNA探针是单 链,极易降解。因此在转录、纯化及随后的杂交操作过程中,要特别注意防止RNase的污染( 详见病毒RNA提取)。

 

上一篇:病毒基因的克隆与鉴定

下一篇:核酸杂交检测技术

首页 | 关于我们 | 网上商城 | 在线客服 | shchuhu.com
业务联系电话
   400-0532-596 0532-66087773
   0532-66087762 0532-81935169
邮箱:qdhbywg@vip.126.com
地址:青岛市城阳区锦汇路1号A2栋
产品技术咨询
  工作日(周一至周六8:00-18:00):
  18562658263 13176865511
  其它时段:13105190021
投诉与建议:13105190021 13006536294