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病毒变异的研究方法(三)



录入时间:2009-6-17 9:01:49 来源:青岛海博

   突变性质的分析:  如上所述,50~70年代中期是开始充分认识和利用病毒变异的最活跃时期,从不断发现的病毒变异现象中人们逐渐总结出有关病毒变异的普遍规律,然而只有在重组DNA技术及其相关技术发展起来之后,才开始真正认识变异的本质。70年代末以来,人们主要从两个方面研究病毒的变异:即分析已有变异的突变性质和研究人工突变对表型的影响(见下)。前者可谓研究突变的传统方法,即首先筛选获得具有特定表现型的变异株,然后分析野生型和变异型之间的基因组序列差异。例如,1991年Parrish等在比较分析犬细小病毒1984年流行株和1986年流行株中发现,两者间仅有2个碱基置换;Wessner和Firlds(1993)分离了一系列具有不同乙醇抵抗力的呼肠孤病毒3变异株,发现所有的乙醇抵抗力突变位于一个编码主要外衣壳蛋白的基因上。病毒变异株的突变分析涉及病毒基因的克隆、核苷酸序列分析等技术,请参阅本书第十五章。 
    人工突变:  如上所述,分析病毒基因突变性质的由表型至基因型的传统方法虽然在一定范围内取得了很大成就,但有许多缺点:首先,它仅限于获得的突变类型;其次,因为整个病毒基因组上均发生突变,目的基因上突变的频率相对减少;第三,由于突变是根据表型识别的,基本上不可能获得与野生型相近的变异株,而它们恰恰对确定基因上的重要区域很有价值。  重组DNA技术使得有可能将传统的方法颠倒过来,首先在克隆的病毒DNA(或cDNA)上通过化学或酶学方法产生人工突变,然后研究其对相关表型的影响。这种方法可产生几乎100%的突变率,且基本上可得到所有可能的突变。例如,Matthias等(1992)在研究VPg基因扩增与口蹄疫病毒(FMDV)感染性粒子形成的关系中发现,克隆缺失或插入一个VPg基因仍能形成感染性病毒粒子,证明FMDV VPg分子数目的可塑性;尽管流感病毒血凝素(NA)的球状头部的结构和功能已经很清楚,但对于其杆状部却了解甚少,Luo等(1993)对编码该部的基因进行缺失、插入或经碱基置换以造成人工突变,结果表明NA杆状部的长度是可变的,缺失28aa或插入41aa并不影响感染性子代病毒的形成,同时数据表明76位的半胱氨酸对于感染性病毒形成是必需的,因为跨过该氨基酸的缺失导致不能产生感染性病毒颗粒;Threadgili等(1993)将马传贫病毒聚合酶基因中的dUTPase区域缺失掉,产生的缺失蛋白具有反转录酶活性,将缺失病毒转染猫(FEA)细胞后产生的病毒在FEA细胞和胎马肾细胞中的复制水平同野生型病毒相似,但在原代马巨噬细胞培养物中复制水平极低(与野生型相比,〈1%),证明病毒编码的dUTPase对于在体外非分化细胞中复制并不是必需的,而对于在天然宿主细胞——非分化性马巨噬细胞中复制则是必需的。

 

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