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    食品卫生微生物学检验空肠弯曲菌检验2——GB



    录入时间:2009-1-9 16:20:16 来源:青岛银河澳门官网入口

    6.操作步骤
    6.1样品的采集及处理食物样品采集后应尽快进行检验。如果样品必须运送和保存,应使用Cary一Blair半固体培养基。弯曲菌的存活时间取决于温度,在25℃情况下,其存活时间不到24h或更短,因此样品在原始分离前需放冰箱或冷处保存。
    6.2微需氧条件的制备最佳微需氧条件是氧气为5%、二氧化碳为10%、氢气为85%。
    6.2.1带有双相压力计(可表示正负压的)厌氧罐:在装皿密封后,先抽去罐内空气至负压7300Pa( 550mmHg)处,输人上述三种混合气体使罐内压力恢复于零;再将罐内气体抽至负压7300Pa( 550mmHg)同样输人上述气体至零,即可放置温箱培养。
    6.2.2气袋法:操作时只使用气体发生剂而不加催化剂。
    6.2.3双平板法:取两块平板,一块平板接种已知的兼性厌氧菌(如变形杆菌),另一块平板接种样品,去掉皿盖,将含琼脂的两只皿相对合齐并用胶布粘封,放人密封不漏气的罐内(或袋内)进行培养。由于兼性厌氧菌生长的代谢作用,可使小环境中的氧气浓度下降和二氧化碳浓度上升。
    6.2.4蜡烛缸法:将已接种细菌的平板置于容量2000mL的磨口标本缸或千燥器内。缸盖及缸口涂以凡士林,放人小段点燃蜡烛于缸内(勿靠近缸壁,以免烤热缸壁而炸裂),盖密缸盖。缸内燃烛约0.5——1min,因氧减少自行熄灭,此时容器内约含二氧化碳5%——10%。最后连同容器一并置于42℃士1℃ 箱中培养。
    6.3分离培养
    6.3.1拭子或液体可直接在选择性培养基如改良Camp一BAP布氏杆菌培养基或使用Skirrow氏培养基平板上划线接种。于42℃ 养48h后,观察可疑菌落。
    6.3.2第一型菌落不溶血,灰色、扁平、湿润、有光泽,看上去像水滴,有从接种线向外扩散的倾向;第二型菌落也不溶血,常呈分散凸起的单个菌落(直径为1mm,边缘完整、发亮)。
    6.4初步鉴定将可疑菌落做氧化酶和过氧化氢酶试验,如为阳性,则涂片做革兰氏染色。本菌为革兰氏明性菌,大小为(0.3um——0.4um)*(1.5um——3um),呈S形、螺旋状或纺锤形。在固体培养基上培养时间过久或在不适条件下则常呈现球形菌。在暗视野或相差显微镜下观察,动力明显。根据菌落生长特征、菌体染色、动力、氧化酶和过氧化氢酶试验阳性者,可初步确定为弯曲菌。
    6.5确定鉴定经初步鉴定后,仍需做下述试验(以下各项试验均需在5%氧气的微需氧环境中培养)。
    6.5.1甘氨酸耐受性试验:接种于甘氨酸培养基中,培养48h。如为阳性,在培养基表面有云雾状生长,则为弯曲菌空肠亚种。
    6.5.2硫化氢生长试验:接种子T鱿斜面上,并吊一根乙酸铅滤纸条于管口,培养物经48h——72h培养,空肠弯曲菌一般在斜面上少量生长,其反应为碱性/碱性(K/K),滤纸条变黑,但培养基底部不因硫化氢而变黑。
    6.5.3对3.5%氯化钠的耐受性试验:接种于3.5%含盐肉汤培养基,经48h培养,空肠弯曲菌不生长。
    6.5.4  42℃和25℃生长试验:将培养物接种于两管布氏肉汤中,一管放于42℃ 一管放于25℃培养48h,42℃ 长而25℃不生长者,则为空肠弯曲菌。
    6.5.5马尿酸钠水解试验:将培养物接种于马尿酸钠培养基,于42℃ 养48h,离心沉淀取出部分上清液。加入三氯化铁试剂,如出现恒久沉淀物则为阳性,空肠弯曲菌呈阳性反应。6.5.6萘啶酸试验:将可疑空肠弯曲菌涂布接种于血平板上,然后贴上含30ug萘啶酸的滤纸于平板上,空肠弯曲菌敏感而肠道弯曲菌不敏感.
    6.5.7 TTC(2,3,5——氯化三苯四氮吐)试验:空肠弯曲菌在TTC培养基上里阳性,而胎儿弯曲菌为阴性,阳性者为紫色菌苔并有光泽。
    6.5.8硝酸盐还原试验:取培养物的浓菌悬液,在37℃ 置2h,加人试剂,观察颜色反应,空肠弯曲菌星红色的阳性反应。6.5.9弯曲菌的生化鉴别见表工。
    6.6生物分型
    6.6.1快速马尿酸钠水解试验:将细菌接种在1%马尿酸钠0.4ml,37℃水浴2h,再加丙酮与丁酮溶液的3.5%茚三酮0.2ml,徐徐加入避免相混,放置10min观察结果。深紫色为阳性,淡紫色或无色为阴性。
    6.6.2快速硫化氢试验,取一环细菌悬浮于快速硫化氢半固体琼脂上三分之一段,37℃水浴2h,观察结果,细菌团块周围变黑为阳性。
    6.6.3 DNA酶水解试验:细菌点种于DNA酶甲基绿琼脂平板上,微需氧环境培养3d——5d,菌苔周围出现无色透明环为阳性。
    6.7血清分型空肠弯曲O因子分型应采用间接血凝法,H或K因子分型可用玻片凝集法。
    6.8菌种保存空肠弯曲菌菌种应接种在改良Camp-BAP斜面培养基上(棉塞不宜过紧),于42℃ 43℃ 需氧中培养48h后,置4℃ 箱微需氧内可保存10d~14d,需要时仍可转种一次,长期保存用冻干法。
    6.9注意事项对空肠弯曲菌检验时,应严格执行无菌操作.防止自身感染。   
       

     

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