5　大肠菌群的测定 
5.1　大肠菌群MPN值的测定 
5.1.1　对每个样品,选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤,每管接种1mL。 
5.1.2　将接种管置于36±1℃培养48±2h。 
5.1.3　观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生,记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。如所有LST肉汤管均未产气,则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者,则进一步作证实试验。 
5.2　大肠菌群的证实试验 
5.2.1　将所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中。
5.2.2　置BGLB肉汤管于36±1℃培养48±2h。 
5.2.3　记录所有BGLB肉汤管的产气管数。 
5.2.4　结果报告：按BGLB肉汤产气管数,查MPN表[见附录B (补充件)]报告每克(毫升)样品中大肠菌群的MPN值。
6　粪大肠菌群测定 
6.1　用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。 6.2　将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内,培养24±2h。水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。应以已知为44.5℃产气阳性的大肠杆菌和44.5℃不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。
6.3　记录EC肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群试验阳性；不产气管为粪大肠菌群试验阴性。
6.4　结果报告：按产气管数,查MPN表报告每克(毫升)样品中粪大肠菌群的MPN值。
7　大肠杆菌测定
7.1　将6.3条中的EC肉汤管继续培养24h,取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板,36±1℃培养24±2h。 
7.2 检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。
7.3　如有典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位,移种到营养琼脂斜面上,36±1℃培养18～24h。 
7.4　将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。
7.4.1　色氨酸肉汤：在36±1℃培养24±2h后,加Kovacs氏试剂0.2～0.3mL,上层出现红色为靛基质阳性反应。
7.4.2 MR-VP培养基：在36±1℃培养48±2h。以无菌操作移取培养物1 mL至13mm×100mm试管中,加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40％氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶,振摇试管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性。将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5 滴甲基红溶液。如培养物变红色,为甲基红试验阳性,若变黄色则为阴性反应。
7.4.3 Koser氏枸椽酸盐肉汤：于36±1℃培养96h记录有无生长 。
7.4.4 LST肉汤：于36±1℃培养48±2h,观察试管中是否产气。
7.4.5　革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。 7.4.6　大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：
靛 基 质 MR  VP  枸椽酸盐 鉴定(型别) 
＋  ＋  －  －  典型大肠杆菌
－  ＋  －  －  非典型大肠杆菌
＋  ＋  －  ＋  典型中间型
－  ＋  －  ＋  非典型中间型
－  －  ＋  ＋  典型产气肠杆菌
＋  －  ＋  ＋  非典型产气肠杆菌
如出现上表以外的生化反应类型,表明培养物可能不纯,应重新划线分离,必要时做 重复试验。
7.5　结果报告：大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌,发酵乳糖产酸产气,IMViC试验为＋＋ －－或－＋－－,再根据LST肉汤阳性管数查MPN表,报告每克(毫升)样品中大肠杆菌MPN 值。   
   

 

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