5 增菌培养和分离
5.1 对新鲜样品,可选择3个连续适宜的稀释度,分别以1mL无菌吸管各吸取1mL稀释液, 接种10mL单料氯化钠多粘菌素B肉汤中,进行选择性增菌培养,每一稀释度接种3 管(若选择的稀释度为接种1g样品时,则应以10mL灭菌吸管吸取1:10稀释液10 mL,接种10 mL双料氯化钠多粘菌素B肉汤中)。对经加热、辐射处理或冷藏、冻结的样品,可按以上操作先将样品接种于60 g/L氯化钠蛋白胨水于37℃前增菌18～24h,然后将培养物以接种环转种到氯化钠多粘菌素B肉汤中进行选择性增菌。
5.2 37℃培养18～24 h。
5.3 氯化钠多粘菌素B肉汤管如有菌生长,则以3 mm直径接种环分别取一环菌液,划线于硫代硫酸钠、柠檬酸钠、胆盐、蔗糖琼脂(TCBS)平板上。
5.4 37℃培养18～24 h。
5.5 副溶血性弧菌在蔗糖琼脂(TCBS)平板上的典型菌落呈圆形,边缘整齐、湿润、稍混浊、半透明,多数具尖心、斗笠状,蓝绿色菌落,直径2～4mm。
6 生化鉴定
6.1 在蔗糖琼脂(TCBS)平板上如出现典型或可疑菌落,每个平板至少挑取两个菌落,每个菌落分别顺次接种到下列培养基进行鉴别试验。
6.1.1 无盐胰胨水。
6.1.2 30g/L氯化钠胰胨水。
6.1.3 氯化钠三糖铁琼脂:先穿刺后划线。
6.2 37℃培养18～24 h。
6.3 选取在氯化钠三糖铁斜面上产碱,在底层产酸,不产气,不产硫化氢；在无盐胰胨水中几乎不生长,在30 g/L氯化钠胰胨水中生长旺盛的菌株进行革兰氏染色、镜检,副溶血性弧菌为革兰氏阴性,呈棒状、弧状、卵圆状等多形态,两端浓染、无芽胞。如符合, 继续进行以下生化鉴定。
6.3.1 嗜盐性试验:各取一环30g/L氯化钠胰胨水培养物,分别接种到70g/L及100g/L氯化钠胰胨水中,37℃培养18～24 h。
6.3.2 细胞色素氧化酶试验:取一环30g/L氯化钠胰胨水培养物划线到胰胨大豆琼脂斜面上,37℃培养18～24 h。
6.3.3 靛基质试验:在6.1.2的30 g/L氯化钠胰胨水培养物中加靛基质试剂后观察反应。
6.3.4 赖氨酸脱羧酶试验:由氯化钠三糖铁斜面以接种针取少许培养物接种到赖氨酸试验用培养基中,37℃培养18～24 h。
6.3.5 精氨酸双水解酶试验:按上项同样操作,将培养物接种到精氨酸试验用培养基中, 37℃培养18～24h。
6.3.6 V-P试验:以接种针由氯化钠三糖铁斜面取少许培养物穿刺V-P半固体琼脂,37℃培养18～24h。在加V-P试剂前应先观察动力。沿穿刺线周围呈扩散性生长为动力阳性。
6.4 副溶血性弧菌生化特性的判定及进一步试验如下。
6.4.1 如所分离的菌株符合表1特性,按第7章报告结果。
表1 副溶血性弧菌的生化特性
鉴定程序 生 化 项 目 反应
初 筛 氯化钠三糖铁
斜面 产碱
底层 产酸,不产气
硫化氢 阴性
嗜盐性
无盐胰胨水 几乎不生长
30 g/L氯化钠胰胨水 生长旺盛
生化鉴别 70 g/L氯化钠胰胨水 明显生长
100 g/L氯化钠胰胨水 几乎不生长
靛基质 阳性
V-P 阴性
动力 阳性
细胞色素氧化酶 阳性
赖氨酸脱羧酶 阳性
精氨酸双水解酶 阴性
扩大生化鉴别 42℃生长 阳性
蔗糖 不分解
O/F试验 发酵型
6.4.2如表1生化项目(扩大生化试验项目除外)中,仅有一项生化试验不符合时,按以下步骤做进一步鉴定
6.4.2.1 蔗糖分解试验,42℃生长试验,O/F试验。如仍符合副溶血性弧菌特性,可按第 7章报告结果,如其中有一项不符合,即可排除。
6.4.2.2 副溶血性弧菌与有关细菌的鉴别可参考表2进行。
表2 副溶血性弧菌与有关细菌鉴别表
试验 副溶血性 溶藻胶 鳗弧菌 创伤 河弧菌 麦氏弧菌 嗜水气单胞菌 类志贺邻单胞菌
TCBS - - + - - - +
(蓝绿色菌落)+
42℃生长 + + - v v - -
盐耐受性试验(生长)
0％氯化钠 - - - - - - + +
60g/L氯化钠+ + + + + + - -
80g/L氯化钠+ + v - + v - -
100g/L氯化钠- + - - - - - -
赖氨酸脱羧酶+ + - + - v - +
精氨酸双水解酶- - v - + + v +
鸟氨酸脱羧酶+ v - v - - - v
蔗糖发酵 - + + - + + v -
乳糖发酵 - - - + - v v v
甘露醇发酵+ + + v + + + -
阿拉伯糖发酵+ - - - + - v -
V-P试验- + v - - + v -
注:空白处表示未试验；ｖ表示可变的。
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