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中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验



录入时间:2008-12-12 9:50:19 来源:青岛银河澳门官网入口

主题内容与适用范围  
     本标准规定了蜡样芽胞杆菌的检验方法。  
     本标准适用于食品和食物中毒样品中蜡样芽胞杆菌的检验。  
2  引用标准  
    GB 4789.2  食品卫生微生物学检验  菌落总数测定  
    GB 4789.28  食品卫生微生物学检验  染色法、培养基和试剂  
3  设备和材料  
3.1  温箱:36±1℃。  
3.2  普能冰箱。  
3.3  显微镜。  
3.4  恒温水浴46±1℃。  
3.5  天平。  
3.6  电炉。  
3.7  吸管:1 mL,10 mL。  
3.8  载玻片。  
3.9  均质器或乳钵。  
3.10  L 型涂布棒。  
3.11  灭菌刀,剪,镊子。  
3.12  三角瓶:容量 500 mL。  
4  培养基和试剂  
4.1  肉浸液肉汤培养基:GB 4789.28 中4.1。  
4.2  酪蛋白琼脂培养基:GB 4789.28 中4.65。  
4.3  动力-硝酸盐培养基:GB 4789.28 中4.72。  
4.4  缓冲葡萄糖蛋白胨水:GB 4789.28 中3.4。  
4.5  血琼脂培养基:GB 4789.28 中4.6。  
4.6  3%过氧化氢溶液。  
4.7  甲萘胺-乙酸溶液。  
4.8  对氨基苯碘酸-乙酸溶液。  
4.9  革兰氏染色液:GB 4789.28 中2.2。  
4.10  甘露醇卵黄多粘菌素(MYP)琼脂培养基:GB 4789.28 中4.64。  
4.11  0.5%碱性复红染色液:GB 4789.28 中2.8。  
4.12  木糖-明胶培养基:GB 4789.28 中4.66。  
5  操作步骤  
6  操作步骤  
6.1  菌数测定  
    以无菌操作将检样 25 g(mL)(按 GB 4789.2 测定),用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液做成 10(-1) ~10(-5) 的稀释液。取各稀释液 0.1 mL,接种在两个选择性培 
养基——甘露醇卵黄多粘菌素(MYP)琼脂培养基上,用L 形棒涂布于整个表面,置 36±1℃温箱培养基 12~20 h 后选取适当菌落数的平板进行计数,蜡样芽胞杆菌在此培养基上的菌落为粉红色(表示不发酵甘露醇)周围有粉红色的晕(表示产生卵磷脂酶)。计算后,从中挑取 5 个此种菌落做证实试验。根据证实为蜡样芽胞杆菌的菌落数计算出该平板上的菌落数,然后乘其稀释倍数,即得每克(或毫升)样品中含蜡样芽胞杆菌数,例如 MYP 平板的可疑菌落数为25个,取5个鉴定,证实为4个,乘上稀释倍数(如10),再乘上 1 g(或 mL)检样数(取的是0.1 mL 样)则为:   
                 25×4/5×10(4) ×10=2×10(6) 
6.2  分离培养  
    取检样或稀释液划线分离培养于选择性培养基(MYP)上,置37℃培养12~20 h,挑取可疑的蜡样芽胞杆菌菌落(见6.1)接种于肉汤和营养琼脂做成纯培养,然后做证实试验。  
6.3  证实试验  
6.3.1  形态观察  
    本菌为革兰氏阳性大杆菌,宽度在 1μm或1μm以上,芽胞呈卵圆形,不突出菌体,多位于菌体中央或稍偏于一端。  
6.3.2  培养特性  
    本菌在肉汤中生长混浊,常微有菌膜或壁环,振摇易乳化;在普通琼脂平板上生成的菌落不透明、表面粗糙、似毛玻璃状或融蜡状,边缘不齐。  
6.3.3  生化性状及生化分型  
6.3.3.1  生化性状  
    本菌有动力;能产生卵磷脂酶和酪蛋白酶;过氧化氢酶试验阳性;溶血;不发酵甘露醇和木糖;常能液化明胶和使硝酸盐还原;在厌氧条件下能发酵葡萄糖。  
6.3.3.2  生化分型  
蜡样芽胞杆菌可根据对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、V-P反应、明胶液化性状的试验,将该菌分成不同的型别。
表 1   蜡样芽胞杆菌生化分型  
                                        生化试验  
  型别  
            柠檬酸盐利用   硝酸盐还原  淀粉水解     V-P 反应     明胶液化 
    1             +              +        +             +           +  
    2             -              +        +             +           +  
    3             +              +        -             +           +     
    4             -              -        +             +           +  
    5             -              -        -             +           +  
    6             +              -        +             +           +  
    7             +              -        -             +           +  
    8             -              +        -             +           +  
    9             -              +        -             -           +  
   10             -              +        +             -           +  
   11             +              +        +             -           +  
   12             +              +        -             -           +  
   13             -              -        +             -           -  
   14             +              -        -             -           +  
   15             +              -        +             -           + 
表 2   蜡样芽胞杆菌与其他类似菌的鉴别
项目 巨大芽胞杆菌 蜡样牙胞杆菌 苏云金芽胞菌 蕈状芽胞杆菌 炭疽芽胞杆
过氧化氢酶 + +   +        +           +
动力          ± ±   ±        -           -
硝酸盐还原 - +   +        +           +
酪蛋白分解 ± +   ±        ±           ±
卵黄反应          - +    +         +            +
葡萄糖利用厌氧 - +    +         +        +
甘露醇          + -    -         -     -
木糖         ± -    -          -   -
溶血          - +    +         ±   ±
已知致病菌特性  产生肠毒素 对昆虫致病的内毒素结晶 假根样生长 对动物和人致病    
注:+90%~100%的菌株阳性;-90%~100%的菌株阴性;±大多数菌株阳性;-(+)大多数菌株阴性。  
本菌在生化性状上与苏云菌芽胞杆菌极为相似,但后者可籍细胞内产生蛋白质毒素结晶加以鉴别。其检查方法如下:取营养琼脂上纯培养物少许,加少量蒸馏水涂于玻片上,待自然干燥后用弱火焰固定,加甲醇于玻片上,半分钟后倾去甲醇,置火焰上干燥,然后滴加 0.5%碱性复红液,并用酒精灯加热至微见蒸气维持 1.5 min,移去酒精灯,将玻片放置半分钟,倾去染液,置洁净自来水充分漂洗,晾干,镜检,在油浸镜下检查有无游离芽胞和深染的似菱形的红色结晶小体(如未形成游离芽胞,培养物应放室温再保存 1~2 d后再检查),如有即为苏云金芽胞杆菌,蜡样芽胞杆菌检查为阴性。

 

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