一、背景介绍

  在中国药典中，对于药品中梭菌检验的分离培养使用的是哥伦比亚琼脂，而在进行方法验证时，则使用质控菌株生孢梭菌对培养基的灵敏度进行测试。然而，许多人在培养生孢梭菌时候发现，用硫乙醇酸盐流体培养基可以比较容易的成功培养生孢梭菌，但用哥伦比亚琼脂经常培养不成功，也会遇到有时候成功有时候失败，或者计数少很多，结果不稳定，有时候怀疑是不是培养基有问题，结果买来中检院的对照培养基使用也是相同的结果，有时候做出来远不如TSA平板计数多，也怀疑过厌氧环境的问题，在此，我们对可能出现的原因进行了多方面的测试和分析。

二、培养失败原因及细节操作分析

  1.培养基除氧。

  这个是我们发现导致培养失败的最主要原因。通过对哥伦比亚琼脂平板的多次测试，培养不成功的主要原因就是配制好的哥伦比亚琼脂平板在正常的空气环境中存放，氧气会逐渐渗入到平板中，在接种生孢梭菌后会对生孢梭菌产生毒害作用，导致生长数量偏少或者不生长。且平板在空气中放置时间越长，效果会越差，短期存放会导致计数结果明显偏少，长时间存放则会导致生孢梭菌几乎不生长。

  因此，在哥伦比亚平板使用之前，将平板放置于厌氧环境中静置24h左右，使平板中的氧气充分逸出，此时再使用时生孢梭菌就可以生长的很好了。除氧可以采用厌氧包处理，也可以将平板放在厌氧培养箱、氮气箱等环境中均可达到理想效果，以下是我们测试的部分实验数据：

  实验数据可以看出，长时间放置的哥伦比亚平板如果未除氧，接种＜100CFU的生孢梭菌都不生长，除氧使用后的哥伦比亚平板回收率明显高了许多，甚至超过了未除氧TSA平板的计数结果（经过多次测试，如果将TSA与哥伦比亚都除氧后再进行准确计数对比，生孢梭菌生长数量是差不多的，但TSA受氧气影响较小，制备好的TSA平板即使存放在空气中很长时间不进行除氧操作，接种生孢梭菌依然可以较好的生长，TSA除氧后的回收率提升不大，这一点与哥伦比亚平板明显不同，其他品牌的TSA目前未进行测试），因此哥伦比亚琼脂平板除氧这一步操作对实验的成功至关重要。

  2.操作时间的影响

  理想状态下，对于生孢梭菌这类绝对厌氧菌的操作应当完全在厌氧箱内操作是最好的，可以很大程度上避免厌氧菌的死亡。但由于许多实验室并不具备厌氧操作的条件，因此只能在正常环境中操作，而生孢梭菌暴露在空气中是极容易死亡的（上述验证试验为最大程度确保试验的数据的准确性，菌种稀释、取出培养基、涂布操作到放入厌氧环境内培养，整个流程不超过10min），所以进行操作中必须动作要快，尽可能的减少培养基和生孢梭菌在空气中暴露的时间，更容易成功。

  3.稀释液的选择

  0.1%蛋白胨水、pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液理论上是优于生理盐水的，特别是操作慢的时候，生孢梭菌在生理盐水中更容易死亡，但在快速操作的时候，稀释液的影响不大。

  4.平皿的透气性

  由于接种后的平板要置于厌氧环境培养，平皿的盖子必须要确保透气性良好，可以与厌氧环境中的气体流动交换，严禁缠封口膜等会导致平皿密闭的操作。

  5.平板的水汽

  在使用小型的厌氧罐、厌氧盒或厌氧培养袋等装置时，由于环境密闭，培养过程中水汽不会散出去，会在内部形成水汽，若在平皿盖子上形成大量水汽，有时候会导致盖子与底皿紧密贴合，平皿内气体不流通，培养失败。因此在做试验前，务必做好充分准备，可先将哥伦比亚平板预先在超净工作台中开盖吹15-30min去除表面水汽进行适当的干燥处理，再将平皿除氧24h后直接使用。

  6.厌氧环境

  厌氧环境对生孢梭菌的生长时至关重要的，可以采用厌氧培养箱，或者使用厌氧罐、厌氧盒、厌氧培养袋等装置，密切监视装置内的环境状况（可使用氧气指示剂进行监测），确保厌氧环境没有问题。

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