一、简介
革兰氏染色（Gram Staining）是用来鉴别细菌的一种方法：这种染色法利用细菌细胞壁上的生物化学性质不同，可将细菌分成两类，即革兰氏阳性（Gram Positive）与革兰氏阴性（Gram Negative）。
有关革兰氏染色的方法、原理、操作步骤和实验现象，本公司网站都有很详细的介绍，具体请参考：https://www.shchuhu.com/microknowsear.asp?keyword=%B8%EF%C0%BC%CA%CF%C8%BE%C9%AB
但经常有试验人员做出的结果出现各种异常，同种菌体不同的人染出的结果不一样，同一个人使用同样的染色液，每次染出的结果也不完全相同。针对这些问题，本文就该实验过程中的注意事项做出较为全面的整理，以期对广大实验人员有所帮助。
二、影响因素
（1）试剂的质量
首先应该保证我们使用的试剂必须是有效的。实验室应当建立有效的试剂管理程序，从试剂的验收到存放、使用、过期后的废弃处理都应有严格规定，确保试剂有效。
A、结晶紫的浓度太高，就会使染上的颜色不容易被酒精脱色，可能会使革兰阴性菌染成革兰阳性菌。
B、碘液作为媒染剂能增加染料与被染物的亲和力。如果碘液放置时间太长，或经日光照射失效，失去媒染剂的作用，就可能使结晶紫与细菌结合的不牢固，容易被脱色，使革兰阳性菌染成革兰阴性菌。
C、酒精作为脱色剂，革兰染色的脱色酒精浓度为95%，在此浓度下革兰阳性菌染上的结晶紫不易被脱去，保留紫色，革兰阴性菌染上的结晶紫容易被脱去，最后呈红色。但当酒精浓度不同时，它的脱色能力也可能有所差异。
为了保证试剂的统一有效性，建议使用商品化的成套试剂。我公司革兰氏染色成套试剂货号为：HB8278，其性能及相关资料可参阅：https://www.shchuhu.com/asphtml/product374.htm。
（2）菌株
A、培养基的成分 有资料显示革兰阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色。但是如果培养基中缺乏核蛋白质镁盐就不能合成菌体成分的核蛋白质镁盐，细菌与碘和结晶紫的复合物结合就不牢固，容易脱色，可能会使革兰阳性菌染成革兰阴性菌。所以尽量选择在一般营养琼脂上纯化培养的菌株进行染色。
B、菌龄 细菌的典型形态、染色性是在对数生长期，取这时的细菌做革兰染色可以反应细菌的真实的染色性。如果细菌培养时间太长，变成了老龄菌，染色性就会发生变化，可能会使革兰阳性菌染成革兰阴性菌。
C、涂片 涂片时，挑取菌体后应该在无菌水上涂成薄薄的菌膜。若是菌体堆积太厚，往往菌体之间变得毫无缝隙，而造成脱色效果不佳，容易产生假阳性的结果，极大影响染色结果的准确性。因此在涂片过程一定要将菌膜涂得少而均匀，这样才能达到最佳效果。同时，在初染、媒染及复染的过程中，应将染液覆盖整个菌膜，避免一部分菌染色而另一部分菌没有染色。
（3）温度
固定不仅能杀死细菌，改变细菌对染料的通透性，还能使细菌吸附在玻片上，保持原有的形态结构。固定方法是将干燥后的细菌涂片以中等速度通过火焰三次，以玻片触及手背皮肤热而不烫为宜。但在实际操作中有的人员将玻片在火焰上烤的太久，改变了细菌原有的通透性，会使细菌的染色性发生变化，影响了染色的结果。
另外菌体固定后，如果载玻片的温度还没完全降下来，就直接用结晶紫初染，也会造成革兰氏阴性菌颜色偏深，误判成假阳性（如图1）。
图1 载玻片不同温度时进行结晶紫初染的试验结果差异
（左：未完全冷却，蓝紫色 右：完全冷却，红色）
（4）时间
A、染色时间 结晶紫初染和碘液媒染时间对革兰氏阴性菌的染色结果有很大影响。时间过长，结晶紫在碘液长时间作用下过分牢固结合在菌体细胞壁上，影响了酒精的脱色效果，从而会导致假阳性的效果。以典型的革兰氏阴性菌大肠埃希氏菌为例，有人做过统计，媒染时间严格控制在40 s-60 s之内，染色结果准确率基本可达到100%，而超过60 s准确率会有一定的降低，若媒染超过100 s，准确率甚至可降低接近20%左右。因此在媒染过程中一定要注意媒染时间。
B、脱色时间 阳性菌透性小，不易被脱色，阴性菌透性大，易脱色；但这是在固定的时间条件下的结果，如果延长脱色时间，也会使脱色剂渗透进阳性菌的细胞壁中，使染上的结晶紫脱去颜色，最后染上复红的颜色，变成革兰阴性菌。而脱色时间太短又会使阴性菌染上的结晶紫不能完全脱色，出现紫色，误认为革兰阳性菌。
洗脱时间应当严格控制在20 s-30 s之间，同时保证洗脱效果，如果操作过程中，洗脱了30 s，还有紫色物质流出，那么应该根据实际情况继续冲洗，直至不再流出紫色物质为止。应根据季节、气温调整染色和脱色时间，一般冬季时间可稍微长些，夏季可稍微短些”。
（5）对照的设置
大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的革兰氏阴性和阳性特征已经被广泛研究，因此可以用作标准对照菌株，在革兰氏染色实验中进行结果验证。
在用革兰氏染色方法鉴定一个未知菌株时，采用大肠杆菌和枯草芽孢杆菌这两种已知的对照菌株同时染色对比，能够保证革兰氏染色实验的准确性和可重复性，也可以根据情况选用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为对照。总之，对于不经常进行本实验的操作人员，每次设置对照同时进行染色操作尤为必要。
三、注意事项
综上所述，试剂的质量、培养基的组成、菌龄、直接的染色操作等，都能影响细菌的染色，还有菌体细胞的构造和其外膜的通透性，如细胞膜的通透性、膜孔的大小和细胞结构完整与否，在染色上都起一定作用。所以我们在染色时要注意当染色结果与预想的结果出现不一致时，要充分考虑到这些因素的影响。同时试验操作时，养成良好的学习态度，严格按照操作规程来做，提高实验结果的准确性。
在整个革兰氏染色过程中，在保证试剂有效的前提下，需要严格控制的几个方面：染色菌必须是在其活跃期内，涂布状态不可太厚，严格控制初染、媒染时间和脱色时间，并保证洗脱效果。为了更准确判断试验结果，应该分别设置阳性对照和阴性对照菌，与待鉴定菌种同时进行染色，对比观察试验结果。
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