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    大肠菌群MPN计数法的两步发酵及讨论

    许英俊
    录入时间:2023-8-21 15:36:36 来源:青岛银河澳门官网入口

    一、大肠菌群简介

      有关大肠菌群,《GB 4789.3-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》中是这样定义的:“在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌”。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。


    二、检验程序

      对于大肠菌群的检验,《GB 4789.3-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》中提供了两种方法,MPN法和平板计数法。其中MPN法采用了两步发酵的方法,检验程序如下(图1)。本文主要对两步发酵方法中使用的两种培养基进行对比和讨论。

    图1  大肠菌群 MPN 计数法检验程序


    三、培养基比较

      检测过程中所用的两款培养基,LST和BGLB比较如表1。

    表1  LST和BGLB培养基的比较

    培养基

    LST

    BGLB

    中文名称

    月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤

    煌绿乳糖胆盐肉汤

    英文名称

    Lauryl Sulfate Tryptose Broth

    Brilliant Green Lactose Bile Broth

    用途

    用于大肠菌群、大肠杆菌的测定。

    用于大肠菌群的确证试验。

    配方(g/L)

    胰蛋白胨

    20.0

    氯化钠

    5.0

    乳糖

    5.0

    磷酸氢二钾

    2.75

    磷酸二氢钾

    2.75

    月桂基硫酸钠

    0.1

    pH值6.8±0.2
    25℃

    蛋白胨

    10.0

    乳糖

    10.0

    牛胆粉

    20.0

    煌绿

    0.0133

    pH值7.2±0.1 25℃

    检验原理

    胰蛋白胨在培养基中作为营养物质提供菌体细胞生长所需要的氮源、维生素、氨基酸及生长因子等;乳糖是可发酵的糖类,提供菌体细胞生长所需要的碳源;氯化钠维持体系渗透压平衡;磷酸盐为菌体生长提供相对稳定的酸碱缓冲体系;月桂基硫酸钠抑制非大肠菌群类细菌的生长。

    蛋白胨提供碳氮源;乳糖是可发酵的糖类;牛胆粉和煌绿抑制非肠杆菌科细菌。

    用法

    称取本品35.6g,加热溶解于1000 mL蒸馏水中,分装到有小倒管的20 mm×150 mm试管中,每管10mL,121℃高压灭菌15分钟,备用。

    称取本品40.0g,加热搅拌溶解于1000 mL蒸馏水中,分装到有倒立发酵管的20 mm×150 mm试管中,每管10 mL,121℃高压灭菌15分钟,备用。

    培养条件

    36℃±1℃培养48h±2h

    36℃±1℃培养48h±2h

    质量控制和典型特征

    大肠埃希氏菌

    浑浊度2,气体充满管内1/3

    浑浊度2,气体充满管内1/3

    弗氏柠檬酸杆菌

    浑浊度2,气体充满管内1/3

    浑浊度2,气体充满管内1/3

    阴沟肠杆菌

    浑浊度2,气体充满管内1/3

    浑浊度2,气体充满管内1/3

    鼠伤寒沙门氏菌

    浑浊度2,不产气

    浑浊度2,不产气

    金黄色葡萄球菌

    浑浊度0(不生长)

    浑浊度0(不生长)

    粪肠球菌

    浑浊度0(不生长)

    浑浊度0(不生长)

    质控图片

    产品选择

    HB0102 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(LST)

    HB0102-3 双料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(LST)

    HBKD0102 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(LST)颗粒

    HBKP0102 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(LST)(颗粒)

    HBPT017 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤LST管(单料,含小倒管)

    HBPT017-1 月桂基硫酸盐蛋白胨肉汤LST管(双料,含小倒管)

    HB0104 煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)

    HBKD0104 煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)颗粒

    HBKP0104 煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)(颗粒)

    HBPT021 煌绿乳糖胆盐肉汤BGLB(含小倒管)

      从表格中可以看出,这两种培养基中都含有乳糖,大肠菌群类的细菌都能利用这两种培养基发酵乳糖产生气体,使用方法也相同。但两者选用的抑菌剂不同:LST中月桂基硫酸钠是抑菌剂,抑制非大肠菌群类细菌的生长,而BGLB中则采用了牛胆粉和煌绿抑制非肠杆菌科细菌的生长。

      两者选用的质控菌株一样:大肠菌群类细菌都能生长良好且产生气体,而沙门氏菌则只能生长,不会产生气体。


    四、讨论

      (1)因为这两种培养基选用的质控菌株完全一样,试验现象也完全一致,导致经常有人会问:只用LST进行发酵不行吗?为什么要用两步发酵?

      首先,两步发酵都利用了乳糖发酵管进行了两次发酵试验,培养基的配制略有不同,但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义,即“在37℃分解乳糖产酸产气”。

    初发酵试验也叫推测试验:样品稀释后,选择三个稀释度,每个稀释度接种三管LST肉汤,36℃±1℃培养48 h±2 h,观察是否产气。

      复发酵试验也叫证实试验:将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中,36℃±1℃培养48 h±2 h,观察是否产气,以BGLB产气为阳性。

      初发酵是样品的发酵结果,不是纯菌的发酵试验,所以初发酵阳性管经过后面的证实试验,有可能成为阴性。初发酵阳性管,不能肯定就是大肠菌群细菌。有数据表明,食品中大肠菌群检验步骤的符合率,推测试验与证实试验相差较大。因此,在实际检测工作中,证实试验是必需的。

      类似两步发酵、两步增菌、同时用多种培养基对同一样品进行增菌分离的情况还有很多,通常来说,但凡标准里面这样要求,一定有其道理和必要性,所以建议操作人员严格按照标准程序进行检验,不要总想走捷径,使检出的结果不符合实际情况。相关文章可参考:

      样品中大肠埃希氏菌的分离方法解读 点击查看

      沙门氏菌检验用增菌培养基的选择与应用 点击查看

      (2)产气量的判断

      实验表明,大肠菌群的产气量,多者可以使发酵倒管全部充满气体,少者可以产生比小米粒还小的气泡。在乳糖发酵试验工作中,经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡(有时比小米粒还小),有时可看到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时,可以用手轻轻打动试管,如有气泡沿管壁上浮,即应考虑可能有气体产生,并作进一步试验。


    相关标准:

    GB 4789.3-2016 大肠菌群计数 -点击下载


    相关产品:

    月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(LST)-点击查看产品详情

    煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)-点击查看产品详情


    注:本文属银河澳门官网入口原创,未经允许不得转载。


     

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