1.范围

  本规范规定了化妆品中耐热大肠菌群的检验方法。

  本规范适用于化妆品中耐热大肠菌群的检验。

2.定义

  2.1 耐热大肠菌群 Thermotolerant coliform bacteria

  系一群需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌，在44.5℃培养24h～48h能发酵乳糖产酸并产气。

  该菌主要来自人和温血动物粪便，可作为粪便污染指标来评价化妆品的卫生质量，推断化妆品中有否污染肠道致病菌的可能。

3.仪器

  3.1 恒温水浴箱或隔水式恒温箱:44.5℃±0.5℃。

  3.2 温度计。

  3.3 显微镜。

  3.4 载玻片。

  3.5 接种环。

  3.6 电磁炉。

  3.7 三角瓶:250mL。

  3.8 试管: 18 mm×150mm。

  3.9 小倒管。

  3.10 pH计或pH试纸。

  3.11 高压灭菌器。

  3.12 灭菌刻度吸管:10mL、1mL。

  3.13 灭菌平皿:直径90mm。

4.培养基和试剂

  4.1 双倍乳糖胆盐（含中和剂）培养基

成分:	蛋白胨	40g
	猪胆盐	10g
	乳糖	10g
	0.4%溴甲酚紫水溶液	5mL
	卵磷脂	2g
	吐温80	14g
	蒸馏水	1000mL

  制法:将卵磷脂、吐温80溶解到少量蒸馏水中。将蛋白胨、胆盐及乳糖溶解到其余的蒸馏水中，加到一起混匀，调pH为7.4，加入0.4%溴甲酚紫水溶液，混匀，分装试管，每管10mL(每支试管中加一个小倒管）。115℃高压灭菌20min。

  4.2 伊红美蓝（EMB）琼脂

成分:	蛋白胨	10g
	乳糖	10g
	磷酸氢二钾	2g
	琼脂	20g
	2%伊红水溶液	20mL
	0.5%美蓝水溶液	13mL
	蒸馏水	1000mL

  制法:先将琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾和蛋白胨，混匀，使之溶解。再以蒸馏水补足至1000mL。调pH值为7.2～7.4，分装于三角瓶内，121℃高压灭菌15min备用。使用前将琼脂融化，于每100mL琼脂中无菌操作加入5mL灭菌的20%乳糖溶液、2mL2%伊红水溶液和1.3mL 0.5%美蓝水溶液，摇匀，冷至45℃～50℃，倾注平皿备用。

  4.3 蛋白胨水（靛基质试验用)

成分:	蛋白胨（或胰蛋白胨)	20g
	氯化钠	5g
	蒸馏水	1000mL

  制法:将上述成分加热融化,调pH值为7.0～7.2,分装小试管，121℃高压灭菌15min。

  4.4 靛基质试剂

  柯凡克试剂:将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中,然后缓慢加入浓盐酸25mL。

  试验方法:接种细菌于蛋白胨水中，于44.5℃土0.5℃培养24h±2h。沿管壁加柯凡克试剂0.3mL～0.5mL，轻摇试管。阳性者于试剂层显深玫瑰红色。

  注:蛋白胨应含有丰富的色氨酸,每批蛋白胨买来后,应先用已知菌种鉴定后方可使用。

  4.5 革兰氏染色液:

  4.5.1 染液制备

  4.5.1.1 结晶紫染色液:

成分:	结晶紫	1g
	95%乙醇	20mL
	1%草酸铵水溶液	80mL

  将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。

  4.5.1.2 革兰氏碘液:

成分:	碘	1g
	碘化钾	2g
	蒸馏水加至	300mL

  将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。

  4.5.1.3 脱色液:95%乙醇。

  4.5.1.4 复染液:

  (1)沙黄复染液:

成分:	沙黄	0.25g
	95%乙醇	10mL
	蒸馏水	90mL

  将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。

  (2)稀石碳酸复红液:称取碱性复红10g，研细，加95%乙醇100mL，放置过夜，滤纸过滤。取该液10mL，加5%石碳酸水溶液90mL混合，即为石碳酸复红液。再取此液10mL加水90mL，即为稀石碳酸复红液。

  4.5.2 染色法

  4.5.2.1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。

  4.5.2.2 滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。

  4.5.2.3 滴加95%乙醇脱色，约30s，或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s，水洗。

  4.5.2.4 滴加复染液，复染1min，水洗，待干，镜检。

  4.5.3 染色结果

  革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

  注:如用1:10稀释石碳酸复红染色液作复染，复染时间仅需10s。

5.操作步骤

  5.1 取10mL 1:10稀释的检液，加到10mL双倍乳糖胆盐（含中和剂)培养基中，置44.5℃±0.5℃培养箱中培养24h±2h，如既不产酸也不产气，继续培养至48h±2h，如仍既不产酸也不产气，则报告为耐热大肠菌群阴性。

  5.2 如产酸产气，划线接种到伊红美蓝琼脂平板上，置36℃±1℃培养18h～24h。同时取该培养液1～2滴接种到蛋白胨水中，置44.5℃±0.5℃培养24h±2h。

经培养后，在上述平板上观察有无典型菌落生长。耐热大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上的典型菌落呈深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽。也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽;或粉紫色、中心较深的菌落，亦常为耐热大肠菌群，应注意挑选。

  5.3 挑取上述可疑菌落，涂片作革兰氏染色镜检。

  5.4 在蛋白胨水培养液中，加入靛基质试剂约0.5mL，观察靛基质反应。阳性反应液面呈玫瑰红色;阴性反应液面呈试剂本色。

6.检验结果报告

  经上述检验步骤，若发酵乳糖产酸产气，平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性无芽胞短杆菌，靛基质试验阳性，则可报告被检样品中检出耐热大肠菌群。

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